【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病的臨床癥狀為懷孕母豬流產(chǎn)和各年齡階段豬的呼吸系統(tǒng)疾病。豬繁殖與呼吸綜合征的病原是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV),該病毒屬動(dòng)脈炎病毒科的單股正鏈RNA病毒,自1991年發(fā)現(xiàn)至今已有20多年之久,主要分為兩種類型:歐洲型(Ⅰ型)和美洲型(Ⅱ型)。中國(guó)發(fā)現(xiàn)并分離的高致病性毒株屬于PRRSVⅡ型。雖然這兩種毒株幾乎同時(shí)被發(fā)現(xiàn),但兩者核苷酸序列的同源性只有70%,并且具有不同的地理分布。自1994年起就已經(jīng)有商品化的PRRSV疫苗問世,然而疫苗免疫并缺乏全面的交叉保護(hù)效果,而且PRRSV感染后引起的抗感染免疫機(jī)制目前仍不甚清晰。鑒于此,亟待需要安全高效的疫苗,新型抗病毒藥物和免疫佐劑的出現(xiàn)以有效控制PRRSV的感染。姜黃素是一種從姜黃根莖提取的具有生物活性的天然多酚類化合物。據(jù)報(bào)道,姜黃素能夠影響細(xì)胞代謝,具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎癥、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等活性。有研究顯示,姜黃素可抑制水皰性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV),丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)和基孔肯雅病毒(chikungunya virus,CHIKV)進(jìn)入細(xì)胞。但目前還沒有關(guān)于姜黃素在PRRSV中的研究報(bào)道。所以本研究主要探討姜黃素在PRRSV感染MARC-145細(xì)胞和豬肺泡巨噬細(xì)胞中對(duì)PRRSV感染的作用。主要結(jié)果如下:1.MARC-145細(xì)胞與不同濃度的姜黃素(0μM,5μM,10μM和15μM)按以下三種方法孵育:(1)姜黃素與PRRSV的混合物與細(xì)胞共孵育1h;(2)PRRSV感染細(xì)胞后與姜黃素共孵育1h;(3)姜黃素預(yù)處理細(xì)胞1h后接入病毒。細(xì)胞樣品和細(xì)胞上清分別用western blot和TCID50進(jìn)行分析。結(jié)果表明姜黃素和病毒的混合物同時(shí)接種入MARC-145細(xì)胞時(shí),姜黃素抑制PRRSV感染,并具有濃度梯度依賴性。無(wú)PRRSV毒株依賴性。2.為了證明姜黃素的抑制作用是否是由于其細(xì)胞毒性以及是否是由于對(duì)細(xì)胞表面PRRSV受體的影響,實(shí)驗(yàn)中選擇CCK-8試劑盒檢測(cè)姜黃素對(duì)MARC-145細(xì)胞的毒性作用,并用western blot方法檢測(cè)細(xì)胞表面受體CD163,非肌肉肌球蛋白重鏈9(non-muscle myosin heavy chain 9,MYH9)蛋白和波形蛋白(vimentin)的表達(dá)情況,結(jié)果表明姜黃素對(duì)MARC-145細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性,MARC-145細(xì)胞表面PRRSV受體表達(dá)無(wú)抑制作用。3.為了研究姜黃素對(duì)PRRSV感染MARC-145細(xì)胞每個(gè)步驟的作用,包括病毒吸附,內(nèi)化和內(nèi)化后感染過程。RT-PCR檢測(cè)病毒吸附實(shí)驗(yàn)中ORF7 mRNA的表達(dá)。Western blot和TCID50分別檢測(cè)病毒內(nèi)化實(shí)驗(yàn)和內(nèi)化后實(shí)驗(yàn)中的N蛋白的表達(dá)和細(xì)胞上清中的子代病毒滴度。進(jìn)一步通過低pH依賴性細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證姜黃素是否阻止病毒G蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞融合。結(jié)果表明:姜黃素對(duì)PRRSV吸附無(wú)抑制作用,而是抑制病毒內(nèi)化以及通過阻止G蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞融合抑制病毒脫衣殼。4.豬肺泡巨噬細(xì)胞PAM(porcine alveolar macrophages,PAM)實(shí)驗(yàn)中,將病毒和姜黃素的混合物與PAM細(xì)胞共同孵育1h。RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中病毒ORF7 mRNA的表達(dá),并檢測(cè)細(xì)胞上清中子代病毒滴度。結(jié)果表明,姜黃素抑制PRRSV感染PAMs。
[Abstract]:Porcine reproductive and respiratory syndrome (porcine * * *) has caused enormous economic losses to the pig industry. The clinical symptoms of this disease are the miscarriage of pregnant sows and respiratory diseases of pigs at all ages. The pathogen of porcine reproductive and respiratory syndrome is the reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), which belongs to the genus. The single-stranded positive-stranded RNA viruses of the family Arteritis Viridae have been discovered for more than 20 years since 1991 and are mainly divided into two types: European (type I) and American (type II). Since 1994, commercial PRRSV vaccines have been available. However, vaccines do not have comprehensive cross-protective effects and the mechanism of anti-infective immunity after PRRSV infection is still unclear. In view of this, safe and efficient vaccines, new antiviral drugs and immune adjuvants are urgently needed. Curcumin is a natural polyphenolic compound with biological activity extracted from the rhizome of Curcuma longa. It has been reported that curcumin can affect cell metabolism, has anti-tumor, anti-oxidation, anti-inflammatory, anti-virus and immune regulation activities. Studies have shown that curcumin can inhibit Vesic stomatitis virus (vesic stomatitis virus). Ular stomatitis virus (VSV), hepatitis C virus, HCV, and Chikungunya virus CHIKV have entered the cell. However, there is no research report on Curcumin in the process of killing. Therefore, this study mainly focused on the effects of curcumin on infection of * cells and porcine alveolar macrophages. The main results were as follows: 1. MARC-145 cells were incubated with curcumin of different concentrations (0, 5, 10 and 15 mu M) in three ways: (1) the mixture of curcumin and PRRSV was co-incubated with cells for 1 hour; (2) PRRSV infected cells were co-incubated with curcumin for 1 hour; (3) curcumin pretreated cells were inoculated with virus after 1 hour. The results showed that curcumin inhibited PRRSV infection in a concentration gradient dependent manner when the mixture of curcumin and virus was inoculated into MARC-145 cells at the same time. The effect of RRSV receptor was tested by CCK-8 kit. The expression of CD163, MYH9 and vimentin on MARC-145 cells was detected by Western blot. The results showed that curcumin had a fine effect on MARC-145 cells. The expression of PRRSV receptor on the surface of MARC-145 cells was not inhibited. 3. To investigate the effect of curcumin on each step of PRRSV-infected MARC-145 cells, including virus adsorption, internalization and post-internalization infection, the expression of ORF7 mRNA was detected by RT-PCR. Viral internalization was detected by Western blot and TCID50, respectively. The results showed that curcumin had no inhibitory effect on PRRSV adsorption, but inhibited virus internalization and G protein mediated cell fusion. Cell fusion inhibits virus (.4.) PAM porcine (alveolar * macrophages, PAM) experiment. The expression of virus ORF7 mRNA was detected by CO incubation of the mixture of virus and curcumin with PAM cells, and the titer of progeny virus in cell supernatants was detected. The results showed that curcumin inhibited the sense of PRRSV. Dyed PAMs.
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S858.28

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本文編號(hào)：2236467