【摘要】：豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一種嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的烈性傳染病。CSF在全球范圍內(nèi)流行,給全世界各地的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。CSFV只有一種血清型,根據(jù)病毒基因組5’NTR、E2和NS5B等基因區(qū)段的核苷酸序列的差異可將CSFV分為3個基因型,其可進一步分為11個基因亞型(1.1~1.4;2.1~2.3;3.1~3.4)。涂長春等于上世紀(jì)九十年代對全國30個省市CSFV臨床樣品進行病原生態(tài)學(xué)和分子流行病學(xué)調(diào)查,研究發(fā)現(xiàn)在我國流行的CSFV主要是2.1、2.2、2.3和1.1亞型,而2.1亞型和2.2亞型作為優(yōu)勢毒株在我國的流行范圍更廣,呈全國性分布。由于2.1基因亞型存在較大的遺傳多樣性,進而又將其分為2.1a、2.1b、2.1c和2.1d基因亞亞型。陳寧等人對2004至2007年采集自我國華南地區(qū)的35份CSFV陽性樣品調(diào)查時發(fā)現(xiàn),其中34份樣品為2.1b亞亞型,只有1份采集于2004年的陽性樣品為2.2亞型。這說明2.1亞型是華南地區(qū)的主要流行毒株。2009年在我國陜西省首次分離獲得了一株2.1a亞亞型毒株SXCDK,蔣大良等報道在湖南和廣東等地區(qū)流行CSFV 2.1c亞亞型的毒株。目前,由于CSF流行在有些國家和地區(qū)得到有效控制,有些國家已宣布徹底消滅了CSF,這也使得一些當(dāng)年的流行毒株成為歷史,比如曾在歐洲流行的基因1.1亞型和曾在亞洲流行的3.3和3.4亞型,近年來已鮮有報道。然而,基因2型悄然成為在世界各地廣泛流行的優(yōu)勢毒株。20世紀(jì)90年代歐洲許多國家曾暴發(fā)2.1亞型毒株引起的CSF疫情,而近年來的報道則以2.2亞型和2.3亞型居多。在我國,2.1型毒株也是主要流行毒株。本實驗利用RT-PCR從三個廣東某豬場的疑似CSF病例中檢測出CSFV,并對擴增的E2全長基因進行了序列測定和系統(tǒng)進化分析。結(jié)果表明,引發(fā)這3起豬瘟疫情的毒株分別屬于CSFV 2.1b基因亞亞型,命名為GD176;CSFV 2.1c基因亞亞型,命名為GD53;CSFV 2.1d基因亞亞型,命名為GD19。為了進一步了解該些毒株的復(fù)制特點,實驗利用PK-15細(xì)胞對三株流行毒株進行了體外細(xì)胞適應(yīng)性傳代,并對獲得的細(xì)胞適應(yīng)毒F46進行了全基因組測序。結(jié)果表明三株流行毒株通過在PK-15上不斷傳代,最終獲得了高滴度的適應(yīng)毒株,GD176的滴度從第6代的102.6TCID50/mL提高至第46代的108.17TCID50/mL,GD53的滴度從第6代的103.39TCID50/mL提高至第46代的108.53TCID50/mL,GD19的滴度從第6代的102.54TCID50/mL提高至第46代的107.88TCID50/mL。病毒生長動力學(xué)結(jié)果顯示三株流行毒株在感染后72h病毒滴度達(dá)到最高值。為了進一步分析三株流行毒株在細(xì)胞傳代適應(yīng)過程中的穩(wěn)定性,實驗對不同代次細(xì)胞毒的E2全長基因進行了擴增和序列測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)三株流行毒株的F0與F6、F10、F15、F20、F25、F30、F35、F40和F46的E2基因序列完全一致,這表明囊膜蛋白E2在病毒適應(yīng)PK-15細(xì)胞過程中非常穩(wěn)定。通過比對三株流行毒株和其他2.1亞型毒株各蛋白的氨基酸序列發(fā)現(xiàn),不同毒株之間同源性最小的病毒蛋白是NS5A,低于病毒囊膜糖蛋白E2。本實驗獲得了高度適應(yīng)PK-15細(xì)胞的CSFV 2.1亞型毒株細(xì)胞毒,為以后進行病毒毒力評價、復(fù)制和致病特性研究奠定了重要基礎(chǔ)。
[Abstract]:Classical swine fever (CSF) is a severe infectious disease caused by Classical swine fever virus (CSFV) that seriously endangers the global pig industry. The prevalence of CSF worldwide has caused huge economic losses to pig industry worldwide. CSFV has only one serotype, according to the virus genome 5'NTR, E2 and NS5B. The difference of nucleotide sequence in isogenic regions can be divided into three genotypes, which can be further divided into 11 genotypes (1.1-1.4; 2.1-2.3; 3.1-3.4). Tu Changchun was the same as in 1990s. Pathogenic ecology and molecular epidemiology of CSFV in 30 provinces and cities in China were investigated. 2.1, 2.2, 2.3 and 1.1 subtypes, while 2.1 and 2.2 subtypes, as dominant strains, are more prevalent in China and are distributed nationwide. The results showed that 34 of the positive samples were 2.1b subtype and only one positive sample was 2.2 subtype collected in 2004. This indicated that 2.1 subtype was the main epidemic strain in South China. In 2009, a 2.1a subtype SXCDK strain was isolated from Shaanxi Province for the first time, and Jiang Daliang reported that it was prevalent in Hunan and Guangdong provinces. At present, due to the effective control of CSF epidemic in some countries and regions, some countries have declared the total elimination of CSF. This also makes some of the epidemic strains become history, such as the 1.1 subtype prevalent in Europe and the 3.3 and 3.4 subtype prevalent in Asia, which have been rarely reported in recent years. Genotype 2 has quietly become the dominant strain in the world. In the 1990s, many European countries had an outbreak of CSF caused by 2.1 subtype strain. In recent years, reports were mostly about 2.2 subtype and 2.3 subtype. CSFV was detected in SF cases, and the full-length E2 gene was amplified and sequenced and phylogenetic analysis was carried out. The results showed that the * 3 strains of swine plague belong to the CSFV 2.1b gene sub type, named GD176, CSFV 2.1c gene sub type, named GD53, CSFV 2.1d gene sub type, named 2.1c, in order to further understand this. According to the replication characteristics of some strains, three strains of epidemic virus were subcultured by PK-15 cells in vitro and the genome of F46 was sequenced. TCID50/mL increased to 108.17TCID50/mL in the 46th generation, the titer of GD53 increased from 103.39TCID50/mL in the 6th generation to 108.53TCID50/mL in the 46th generation, and the titer of GD19 increased from 102.54TCID50/mL in the 6th generation to 107.88TCID50/mL in the 46th generation. Further analysis of the stability of the three epidemic strains in the process of cell passage adaptation showed that the sequence of E2 gene of the three epidemic strains was identical with that of F6, F10, F15, F20, F25, F30, F35, F40 and F46, suggesting that the envelope protein E2 was adapted to PK-6. By comparing the amino acid sequences of the proteins of the three epidemic strains and the other 2.1 subtypes, it was found that the homology between the three strains was the smallest, which was NS5A, lower than the envelope glycoprotein E2. In this experiment, the CSFV 2.1 subtype virus strain which was highly adapted to the PK-15 cells was obtained, and it was used as the virus for further study. Virulence evaluation, replication and pathogenicity studies laid an important foundation.
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

【共引文獻】

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本文編號：2228089