【摘要】：【目的】確定理想的牦牛瘤胃細(xì)菌基因組DNA提取方法及初步分析牦牛瘤胃細(xì)菌的群體結(jié)構(gòu)。【方法】采用物理法(珠磨法、反復(fù)凍融法)、化學(xué)法(CTAB、SDS)及酶解法(溶菌酶、蛋白酶K)三者與瘤胃細(xì)菌特點(diǎn)相結(jié)合的方法,組合生成9種不同方法,即方法 1(CTAB+SDS+Lysozyme+無特殊物理處理法)、方法 2(CTAB+SDS+Lysozyme+反復(fù)凍融法)、方法 3(CTAB+SDS+Lysozyme+珠磨法)、方法 4(CTAB+Lysozyme+無特殊物理處理法)、方法 5(CTAB+Lysozyme+反復(fù)凍融法)、方法 6(CTAB+Lysozyme+珠磨法)、方法 7(SDS+Lysozyme+無特殊物理處理法)、方法 8(SDS+Lysozyme+反復(fù)凍融法)、方法 9(SDS+Lysozyme+珠磨法),同時(shí)以QIA amp DNA Stool Mini Kit(方法 10)為對(duì)照,以這10種方法來提取瘤胃微生物基因組DNA,并通過DNA濃度、純度、DNA電泳圖等基本性質(zhì)及16S r RNA高通量測(cè)序結(jié)果對(duì)其進(jìn)行分析比較,同時(shí)通過測(cè)序結(jié)果初步分析牦牛瘤胃細(xì)菌群體結(jié)構(gòu)�！窘Y(jié)果】不同DNA提取方法效率比對(duì)結(jié)果顯示,同樣的化學(xué)及生物酶裂解條件下,結(jié)合珠磨法及反復(fù)凍融法能夠顯著地增強(qiáng)細(xì)胞裂解效率,提高DNA產(chǎn)量。其中方法 3及方法 6提取的DNA具有較高的濃度及純度,方法 7—10缺乏CTAB陽(yáng)離子去污劑,提取的DNA量顯著低于其他方法(P0.05),除方法 2和8所提取的樣品經(jīng)多次試驗(yàn),PCR產(chǎn)物目的條帶太弱或未檢測(cè)到外,其余8種方法提取的樣品PCR產(chǎn)物目的條帶大小正確,濃度合適,符合高通量測(cè)序的要求。16S r RNA高通量測(cè)序共生成了191 349條原始數(shù)據(jù),質(zhì)控后得到有效序列171 231條。稀釋性曲線分析表明,數(shù)據(jù)量合理并達(dá)到飽和,能夠完整反映樣品的菌群種類。OTU聚類數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、分類學(xué)和多樣性指數(shù)分析顯示方法 6和10包含的細(xì)菌較豐富。不同提取方法對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌提取效果比對(duì)結(jié)果表明方法 6裂解革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁的能力比其他方法相對(duì)較高。綜上,方法 6(CTAB-Lysozyme-珠磨)提取的DNA產(chǎn)量、樣品多樣性指數(shù)及革蘭氏陽(yáng)性菌破壁能力均優(yōu)于其他方法。菌群結(jié)構(gòu)分析表明牦牛瘤胃細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)包括21門、35綱、75科、112屬,豐度較高的菌群依次是擬桿菌Bacteroidtes(64%)、厚壁菌Firmicutes(20%)、螺旋體Spirochaetae(2.3%)和變形菌Proteobacteri(1.8%),纖維桿菌Fibrobacter(1.7%)。牦牛瘤胃細(xì)菌群體結(jié)構(gòu)與黃牛相比存在著一定的差異,這可能歸因于飲食及環(huán)境的不同。【結(jié)論】利用16S r RNA高通量測(cè)序篩選出了牦牛瘤胃細(xì)菌基因組DNA理想提取方法,即方法 6(CTAB-Lysozyme-珠磨),并初步分析了牦牛瘤胃細(xì)菌群體結(jié)構(gòu),為研究牦牛瘤胃微生物群體特殊性及挖掘牦牛體內(nèi)的基因資源奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:[Objective] To determine an ideal method for extracting genomic DNA from rumen bacteria of yak and to analyze the population structure of rumen bacteria. Methods: 1 (CTAB + SDS + Lysozyme + no special physical treatment), 2 (CTAB + SDS + Lysozyme + repeated freeze-thaw), 3 (CTAB + SDS + Lysozyme + bead milling), 4 (CTAB + Lysozyme + no special physical treatment), 5 (CTAB + Lysozyme + repeated freeze-thaw), 6 (CTAB + Lysozyme + bead milling), 7 (SDS + Lysozyme + no special substance). Methods 8 (SDS + Lysozyme + repeated freeze-thaw method), 9 (SDS + Lysozyme + bead milling method) and QIA amp DNA Stool Mini Kit (method 10) were used to extract genomic DNA of rumen microorganisms by these 10 methods. The genomic DNA of rumen microorganisms was analyzed by DNA concentration, purity, DNA electrophoresis and 16S R RNA high-throughput sequencing. The results showed that under the same conditions of chemical and biological enzymatic lysis, the combination of bead milling and repeated freeze-thaw method could significantly enhance the cell lysis efficiency and DNA production. Methods 7-10 lacked CTAB cationic detergent, and the amount of DNA extracted was significantly lower than that of other methods (P 0.05). Except for the samples extracted by methods 2 and 8, which were too weak or undetected after many tests, the bands of PCR products extracted by other eight methods were correct in size and proper in concentration. 16S R RNA high-throughput sequencing produced 191 349 original data, and 171 231 effective sequences were obtained after quality control. Dilution curve analysis showed that the amount of data was reasonable and saturated, which could fully reflect the species of bacteria. OTU cluster data statistics, taxonomy and diversity index analysis showed methods 6 and 6. The results showed that the ability of method 6 to lyse the cell wall of Gram-positive bacteria was higher than that of other methods. In summary, the DNA yield, diversity index of samples and the ability of Gram-positive bacteria to break the cell wall of method 6 (CTAB-Lysozyme-bead mill) were superior to other methods. Methods. The microflora structure analysis showed that the rumen microflora of yak included 21 phyla, 35 classes, 75 families and 112 genera. The higher abundance of the microflora were Bacteroides (64%), Firmicutes (20%), Spirochaetae (2.3%) and Proteobacteri (1.8%), Fibrobacter (1.7%). [Conclusion] An ideal method for genomic DNA extraction of yak rumen bacteria was screened out by 16S R RNA high-throughput sequencing, that is, method 6 (CTAB-Lysozyme-bead mill), and the structure of yak rumen bacterial population was preliminarily analyzed to study the rumen microbial population of yak. Particularity and digging the genetic resources of yak body laid the foundation.
【作者單位】： 西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院;西南民族大學(xué)青藏高原研究院;
【基金】：西南民族大學(xué)中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(2015NZYTD01) 西南民族大學(xué)研究生學(xué)位點(diǎn)建設(shè)項(xiàng)目(2014XWD-S0906) 四川省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目(15ZA0386) 西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新型科研項(xiàng)目(CX2016SZ079)
【分類號(hào)】：S823.85

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本文編號(hào)：2221029