【摘要】：新城疫是由新城疫病毒引起的嚴(yán)重威脅養(yǎng)禽業(yè)的一種病毒性傳染病。新城疫病毒屬于副粘病毒科禽腮腺炎病毒屬。水禽特別是鴨和鵝通常被認(rèn)為是新城疫病毒潛在的宿主,即使感染對(duì)雞具有高死亡率特征的強(qiáng)毒株,也很少甚至不表現(xiàn)任何臨床癥狀。但是,在過(guò)去十幾年中許多國(guó)家和地區(qū)都有水禽感染新城疫病毒的報(bào)道。本次研究中的19株新城疫病毒均是從鴨的樣品中分離,其中18株病毒是從臨床健康鴨的泄殖腔拭子中分離,1株病毒是從發(fā)病鴨的腎臟中分離。所有的樣品稀釋后接種9~10日齡SPF雞胚尿囊腔,然后通過(guò)血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)對(duì)雞胚尿囊液進(jìn)行血清學(xué)鑒定。強(qiáng)毒株用蝕斑純化法在原代雞胚成纖維細(xì)胞中純化,弱毒株用有限稀釋法在雞胚中純化。將純化后的病毒擴(kuò)繁后,提取RNA并用一步法RT-PCR分段擴(kuò)增病毒全基因組,將PCR產(chǎn)物亞克隆到p MD18-T載體并進(jìn)行序列測(cè)定、拼接、比對(duì)和分析。19株NDV毒株基因組序列分析表明,這些病毒的基因組分為3種長(zhǎng)度,15186 nt,15192 nt和15198 nt,符合新城疫病毒復(fù)制所需的“六堿基原則”,19株病毒基因組的基因順序均為3?-NP-P-M-F-HN-L-5?;所有序列的差異性在0%到28.3%之間;F蛋白裂解位點(diǎn)是預(yù)測(cè)NDV毒力的重要依據(jù),19株病毒中,Md/CH/LGD/1/2005的裂解位點(diǎn)為112RRQKRF117,具有典型的強(qiáng)毒株裂解位點(diǎn)特征,與class II系基因VIId型毒株相似;Du/CH/LAH/224/2011和Du/CH/LAH/209/2011的裂解位點(diǎn)分別為112GKQGRL117和112GRQGRL117,具有典型的弱毒株分裂位點(diǎn)特征,分別與class II系基因I型和II型疫苗毒株相似;16株病毒的裂解位點(diǎn)均為112ERQERL117,具有典型的弱毒株裂解位點(diǎn)特征,在野鳥(niǎo)和家鴨分離株中均有報(bào)道。根據(jù)F基因高變區(qū)和全基因組序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,至少有4種基因型的新城疫病毒在國(guó)內(nèi)家鴨的體內(nèi)存在:Md/CH/LGD/1/2005屬于class II系基因VIId型,是上個(gè)世紀(jì)末開(kāi)始大多數(shù)新城疫爆發(fā)的主要基因型;Du/CH/LAH/224/2011屬于class II系基因Ib,與CBU2374毒株類似;Du/CH/LAH/209/2011屬于class II系基因II型;其余16株病毒屬于class I系基因1b型,是中國(guó)水禽的流行基因型。根據(jù)19株鴨源新城疫病毒的分子特征和遺傳進(jìn)化分析,選出7株鴨源新城疫病毒進(jìn)行致病性試驗(yàn);并根據(jù)F基因高變區(qū)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),選出8株不同宿主的毒株作為參考,同樣進(jìn)行致病性試驗(yàn)。Md/CH/LGD/1/2005的ICPI值為1.88,MDT值為50 h,鑒定為強(qiáng)毒株。其他毒株的ICPI值在0到0.34之間,MDT值在125h到168h,鑒定為弱毒株。與此同時(shí),我們還選擇病毒的宿主(鴨)作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,來(lái)進(jìn)行致病性試驗(yàn)。根據(jù)19株鴨源新城疫病毒的遺傳進(jìn)化分析和致病性試驗(yàn)的特點(diǎn),選出6株鴨源新城疫病毒,并從實(shí)驗(yàn)室分離到的毒株中選出不同宿主不同基因型的17株病毒,制備單因子血清,然后進(jìn)行交叉血凝抑制試驗(yàn)。結(jié)果表明新城疫病毒株的抗原相關(guān)性可能與基因型有關(guān),而與宿主無(wú)關(guān)。以上結(jié)果表明,鴨源新城疫病毒與鴿源新城疫病毒不同,鴨源新城疫病毒在遺傳進(jìn)化和抗原性方面沒(méi)有形成獨(dú)立的進(jìn)化分支,據(jù)此推測(cè)鴨源新城疫病毒可能來(lái)源于其他禽類。新城疫病毒存在于鴨體內(nèi),可能是為了適應(yīng)新的宿主,新城疫病毒發(fā)生了一定程度的變異,因此鴨和鴨胚能更真實(shí)地反應(yīng)鴨源新城疫病毒的致病性。鴨源新城疫病毒在新城疫病毒進(jìn)化中起到重要的作用。
[Abstract]:Newcastle disease (NDV) is a viral infectious disease caused by Newcastle disease virus (NDV) which is a serious threat to poultry industry. Newcastle disease virus (NDV) belongs to the paramyxovirus family avian mumps virus. Waterfowls, especially ducks and geese, are often considered as potential hosts of NDV, and rarely, if not manifested, even if infected with a virulent strain with high mortality to chickens. In this study, 19 strains of Newcastle disease virus were isolated from duck samples, 18 of which were isolated from cloacal swabs of clinically healthy ducks, and one strain was isolated from kidneys of infected ducks. The samples were diluted and inoculated into the allantoic cavity of 9-10 day-old SPF chicken embryos. The chicken embryo allantoic fluid was serologically identified by hemagglutination test and hemagglutination inhibition test. The virulent strain was purified in the primary chicken embryo fibroblasts by plaque purification method, and the attenuated strain was purified in the chicken embryos by limited dilution method. Genome sequence analysis of 19 NDV strains showed that the genomes of these viruses were divided into three lengths, 15186 nt, 15192 nt and 15198 nt, which accorded with the "six base principle" for the replication of Newcastle disease virus. The genome sequence of the strains was 3? -NP-P-M-F-HN-L-5?; all the sequences were between 0% and 28.3%. The F protein cleavage site was an important basis for predicting NDV virulence. Of the 19 strains, the cleavage site of Md/CH/LGD/1/2005 was 112RRQKRF117, which had typical characteristics of the cleavage site of the virulent strain and was similar to the type VIId strain of the class II gene. Similarly, the splitting sites of Du/CH/LAH/224/2011 and Du/CH/LAH/209/2011 were 112 GKQGRL117 and 112 GRQGRL117, respectively, with typical splitting site characteristics of attenuated strains, similar to class II genotype I and type II vaccine strains; the splitting sites of 16 strains were 112 ERQERL117, with typical splitting site characteristics of attenuated strains in wild birds and families. According to phylogenetic analysis of F gene hypervariable region and whole genome sequence, at least four genotypes of NDV were found in domestic ducks: Md/CH/LGD/1/2005 belonged to class II gene VIId, which was the main genotype of most NDV outbreaks since the end of last century; Du/CH/LAH/224/2. 011 belongs to class II gene Ib, similar to CB2374 strain; Du/CH/LAH/209/2011 belongs to class II gene type II; the remaining 16 strains belong to class I gene 1b, which is the epidemic genotype of Chinese waterfowls. According to the molecular characteristics and genetic evolution analysis of 19 strains of Duck-Derived Newcastle disease virus, 7 strains of Duck-Derived Newcastle disease virus were selected for pathogenicity test. The ICPI value of Md/CH/LGD/1/2005 was 1.88, the MDT value was 50 h, and the other strains were identified as virulent strains. The ICPI value of other strains ranged from 0 to 0.34, and the MDT value ranged from 125 h to 168 h. At the same time, we also selected weak strains. According to the characteristics of genetic evolution and pathogenicity test of 19 strains of Newcastle disease virus from ducks, six strains of Newcastle disease virus from ducks were selected, and 17 strains of virus with different genotypes were selected from the strains isolated in the laboratory. The single factor serum was prepared and then crossed. The results showed that the antigenic correlation of Newcastle disease virus strain may be related to genotype, but not to host. The above results showed that, unlike pigeon-borne Newcastle disease virus, duck-borne Newcastle disease virus did not form an independent evolutionary branch in genetic evolution and antigenicity. Newcastle disease virus exists in ducks. It may be that Newcastle disease virus has mutated to a certain extent in order to adapt to the new host. Therefore, duck and duck embryos can more truly reflect the pathogenicity of Newcastle disease virus from ducks. Newcastle disease virus from ducks plays an important role in the evolution of Newcastle disease virus.
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2217574