【摘要】：偽狂犬病毒(PRV)屬于a皰疹病毒,嚴(yán)重危害豬,每年給養(yǎng)殖業(yè)帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失。gE是PRV的重要毒力基因,與gI形成的功能復(fù)合體對病毒在細(xì)胞間擴(kuò)散和對神經(jīng)系統(tǒng)的侵染有重要作用。目前gE基因缺失疫苗被廣泛用于PRV的防控,結(jié)合抗體檢測,作為標(biāo)記基因的gE基因也可以用來區(qū)分疫苗接種豬和野毒感染豬。MicroRNA(簡寫miRNA)是長度約20-24nt的單鏈小RNA分子,調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平。大量研究證明,病毒和宿主都可以利用miRNA調(diào)節(jié)自身與對方的轉(zhuǎn)錄物,來實(shí)現(xiàn)免疫逃避和自我保護(hù)。病毒侵染可導(dǎo)致宿主miRNA表達(dá)譜發(fā)生變化,可以為其生存創(chuàng)造有利條件,同時宿主也可以利用miRNA來實(shí)現(xiàn)免疫清除。本研究將PRV及PRV-gEgl分別接種豬腎傳代細(xì)胞系(PK-15),24h后分別提取總的RNA,通過solexa測序技術(shù)并結(jié)合生物信息學(xué)方法,對兩株病毒侵染PK-15細(xì)胞前后的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行深入的分析。高通量測序結(jié)果顯示,在PRV感染后與PRV-gEgl感染后以及未感染的PK-15細(xì)胞中分別檢測了miRBase19.0數(shù)據(jù)庫豬源成熟miRNA中的218個、221個、225個。除已知的miRNA外,3個樣本還分別鑒定出大量新的豬源miRNA以及5個新的病毒miRNA。通過qRT-PCR驗(yàn)證隨機(jī)篩選出的12個miRNA,發(fā)現(xiàn)與高通量測序結(jié)果變化趨勢相一致,表明測序結(jié)果真實(shí)可信,可用于后續(xù)差異分析。與未感染的PK-15細(xì)胞相比較,PRV感染與PRV-gEgl感染后的PK-15細(xì)胞中均鑒定出差異顯著的miRNA,分別為137個和135個,從中各自篩選出9個差異突出的miRNA并整合TargetScan和miRanda兩個數(shù)據(jù)庫的算法,預(yù)測它們的靶基因,構(gòu)建miRNA-target調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。其中下調(diào)的ssc-miR-24-3p調(diào)控的靶基因最多,ssc-miR-30a-5p與ssc-miR-30d在PRV感染組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置,ssc-miR-10a-5p與ssc-miR-10b在PRV-gEgl感染組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置,影響這整個網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性。PRV-gEgl感染組相對于PRV感染組有85個(60個上調(diào),25個下調(diào))差異顯著的miRNA,表明基因缺失對細(xì)胞miRNA的表達(dá)有不同影響。為了了解病毒侵染后細(xì)胞異常表達(dá)的miRNA對病毒的作用,本研究隨機(jī)選取了ssc-miR-34a、ssc-miR-19、ssc-miR-145-5p和ssc-miR-499-5p,將它們分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞后接毒,在12和36h時分別收毒。通過熒光定量檢測結(jié)果顯示ssc-miR-34a、ssc-miR-16對PRV復(fù)制有抑制作用。本研究鑒定了PRV感染與PRV-gEgl感染PK-15細(xì)胞前后的miRNA表達(dá)譜,并通過對它們進(jìn)行比對分析,加深病原宿主互作機(jī)制的理解,也對gEgl對細(xì)胞的作用有了新的認(rèn)識。基于miRNA的病原宿主互作機(jī)制的深入分析為從miRNA角度防控PRV奠定一些基礎(chǔ),也可以為其作為疫苗、載體或者是神經(jīng)傳導(dǎo)示蹤等方面的應(yīng)用提供理論參考。
[Abstract]:Pseudorabies virus (PRV) belongs to herpesvirus a, which seriously harms pigs. It brings great economic loss to breeding industry every year. GE is an important virulence gene of PRV. The functional complexes formed with gI play an important role in the spread of the virus between cells and the nervous system. At present, gE gene deletion vaccine is widely used in the prevention and control of PRV. Combined with antibody detection, the marker gene gE gene can also be used to distinguish vaccine-inoculated pigs from wild virus infected pigs. MicroRNA (miRNA) is a single strand small RNA molecule with a length of about 20-24nt. The post-transcriptional expression of genes is regulated. A large number of studies have proved that both virus and host can use miRNA to regulate their own and the other side of the transcription to achieve immune evasion and self protection. The miRNA expression profile of the host can be changed by virus infection, which can create favorable conditions for its survival. At the same time, the host can also use miRNA to achieve immune clearance. In this study, PRV and PRV-gEgl were inoculated into porcine kidney passage cell line (PK-15) 24 hours later, the total RNA, was extracted respectively by solexa sequencing and bioinformatics, and the miRNA expression profiles of PK-15 cells before and after the two viruses were infected were analyzed. The high-throughput sequencing results showed that 218, 221 and 225 of mature miRNA from pig origin in miRBase19.0 database were detected in PK-15 cells after PRV infection and PRV-gEgl infection, as well as in uninfected PK-15 cells. In addition to known miRNA, a large number of new porcine miRNA and five new virus miRNA. were identified in the three samples. The results of 12 miRNA, screened by qRT-PCR were consistent with the trend of high throughput sequencing, which indicated that the sequencing results were reliable and could be used for subsequent differential analysis. Compared with the uninfected PK-15 cells, 137 and 135 PK-15 cells with significant difference were identified in the PK-15 cells infected with PK-15 and PRV-gEgl, respectively, and 9 miRNA were screened out respectively and the algorithms of integrating TargetScan and miRanda databases were obtained. Their target genes were predicted and miRNA-target regulatory network was constructed. Ssc-miR-30a-5p and ssc-miR-30d are the most down-regulated target genes in the PRV infection control network. Ssc-miR-10a-5p and ssc-miR-10b are at the core in the PRV-gEgl infection control network. There were 85 (60 up-regulated, 25 down-regulated) miRNA, in PRV-gEgl infection group as compared with PRV infection group. The significant difference of miRNA, indicated that gene deletion had different effects on the expression of miRNA. In order to understand the effect of the abnormal expression of miRNA on the virus, ssc-miR-34a,ssc-miR-19,ssc-miR-145-5p and ssc-miR-499-5p, were randomly selected to transfect them into the cells and inoculated with the virus at 12 h and 36 h, respectively. The results of fluorescence quantitative detection showed that ssc-miR-34a,ssc-miR-16 could inhibit the replication of PRV. In this study, the expression profiles of miRNA in PK-15 cells before and after PRV infection and PRV-gEgl infection were identified, and by comparing and analyzing them, the mechanism of pathogenetic host interaction was further understood, and a new understanding of the effect of gEgl on PK-15 cells was also obtained. The further analysis of the pathogen-host interaction mechanism based on miRNA can lay a foundation for the prevention and control of PRV from the point of view of miRNA, and can also provide theoretical reference for its application as vaccine, carrier or nerve conduction tracer.
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

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本文編號：2215583