【摘要】：旋毛蟲是一種全球范圍分布的危害嚴(yán)重的食源性人獸共患寄生蟲病。主要發(fā)病原因是因為宿主食用了生的或未熟的含有感染性包囊的肉類食品而感染,感染嚴(yán)重時可致死亡。幾乎所有的哺乳動物均可以被感染。近年相繼在幾種寄生蟲分離并鑒定除了絲氨酸蛋白酶抑制劑家族。研究表明,絲氨酸蛋白酶抑制劑具有獨特的酶抑制活性,能夠保護(hù)寄生蟲抵制宿主消化液的消化,參與寄生蟲在宿主體內(nèi)的移行過程,能夠利于寄生性線蟲的發(fā)育并抵抗宿主的免疫反應(yīng)。根據(jù)NCBI上已發(fā)表的旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑Tsp Ad5、TS11-1、Tsp03044、Tsp03548(其基因序列登錄號分別為:EU263307、AF231948.1、XM_003379333、XM_003379851)設(shè)計實時熒光定量引物,應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)分別將克隆的目的片段與p MD-18T克隆載體連接后,各自轉(zhuǎn)化入克隆感受態(tài)細(xì)胞DH5α中。經(jīng)菌液PCR鑒定和測序公司測序后對克隆到的序列進(jìn)行序列分析正確,隨后制備相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品,并建立相對應(yīng)的實時熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。為闡明四種Ts-SPI在旋毛蟲不同發(fā)育時期蟲體內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量的情況,將收集的不同時期的旋毛蟲蟲體提取總RNA進(jìn)行RT-PCR,分析不同發(fā)育時期里旋毛蟲四種Ts-SPI基因在mRNA水平的表達(dá)量差異。結(jié)果顯示,Tsp Ad5和TS11-1在旋毛蟲感染后3d的成蟲期出現(xiàn)一個轉(zhuǎn)錄高峰,3d時表達(dá)量明顯高于1d和5d的表達(dá)量(p㩳0.01),5d時較NBL略低(p0.05);成囊前期,表達(dá)量很低,其中18d時表達(dá)量最低(p㩳0.05);另一高峰出現(xiàn)在感染后第38天的肌幼蟲時期,且差異具有顯著性(p㩳0.05)。Tsp03044在成蟲時期,3d時的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量明顯高于其他時期的表達(dá)量且差異具有極顯著性(p㩳0.01);成囊前期中18d時表達(dá)量最低(p㩳0.05),22d時轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)高峰(p㩳0.01),差異極顯著。Tsp03548在3d時轉(zhuǎn)錄略高于1d和5d的表達(dá)量(p㩳0.05),5d時較NBL略低(p㩳0.05)且具有差異顯著性;成囊前期中18d時出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄表高峰(p㩳0.01);肌幼蟲時期均有表達(dá)(p㩳0.05)且差異顯著。本實驗應(yīng)用免疫熒光技術(shù)研究四種Ts-SPI在旋毛蟲不同發(fā)育時期蟲體內(nèi)分布的情況,并對四種Ts-SPI與宿主的相互作用進(jìn)行分析。免疫熒光定位結(jié)果顯示,TspAd5和TS11-1在成蟲表皮組織和肌肉蟲的表皮和體內(nèi)均大量表達(dá),在新生幼蟲和成囊前期幼蟲的蟲體也有表達(dá)。Tsp03044在新生幼蟲的蟲體的體內(nèi)和表皮表達(dá)量略少,在其他時期的體內(nèi)均明顯可見其紅色熒光效果顯著。Tsp03548明顯可見定位于成囊前期幼蟲的表皮組織和體內(nèi);成蟲的表皮組織和新生幼蟲的蟲體的表皮和體內(nèi)也有表達(dá),但整體紅色熒光效果很弱;肌幼蟲的體內(nèi)和表皮也均有表達(dá)。本實驗對四種Ts-SPI在旋毛蟲不同發(fā)育時期蟲體內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量和蟲體分布的情況進(jìn)行研究,通過應(yīng)用實時熒光定量PCR和免疫熒光定位技術(shù)對Tsp Ad5、TS11-1、Tsp03044、Tsp03548在不同發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量變化和蟲體表達(dá)部位的進(jìn)行分析,不僅為闡明旋毛蟲不同發(fā)育階段的蛻變機(jī)制奠定基礎(chǔ),也為闡明旋毛蟲侵襲宿主的過程中的免疫逃逸機(jī)制以及新型的抗旋毛蟲及相關(guān)寄生蟲藥物研發(fā)打下結(jié)實基礎(chǔ)。
[Abstract]:The results showed that Tsp Ad5 and TS11 - 1 were able to inhibit the development of parasitic nematodes and to resist the immune response of host . The results showed that Tsp Ad5 and TS11 - 1 were able to inhibit the development of parasitic nematodes and to resist the immune response of hosts .
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2127614