【摘要】：乳脂是牛奶中重要的營(yíng)養(yǎng)成分之一,乳脂含量是衡量牛奶質(zhì)量的重要指標(biāo)。乳脂合成受到多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié),其中雷帕霉素靶蛋白(themechanistic target of rapamycin,mTOR)信號(hào)通路對(duì)乳脂合成發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。mTOR是一種絲/蘇氨酸激酶,屬于磷酸肌醇3(phosphatidylinositol 3-kinase-related kinase,PIKK)蛋白激酶家族。mTOR作為核心組分與其他不同蛋白形成兩種復(fù)合物,mTOR complex 1(mTORC1)和mTOR complex 2(mTORC2).mTORC1和mTORC2在胞內(nèi)發(fā)揮不同的作用,mTORC1主要在調(diào)控細(xì)胞的增殖、代謝及蛋白合成等方面發(fā)揮作用;mTORC2則參與調(diào)控細(xì)胞骨架、細(xì)胞遷移及代謝等過(guò)程。目前,關(guān)于mTORC1在乳脂合成調(diào)控方面的研究報(bào)道比較多,而mTORC2尚顯不足,二者在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中對(duì)乳脂合成的調(diào)控作用對(duì)比也鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)驗(yàn)室分離并純化得到的奶牛乳腺上皮細(xì)胞作為研究模型,首先應(yīng)用ATP競(jìng)爭(zhēng)性mTOR抑制劑AZD8055處理細(xì)胞,同時(shí)抑制mTORC1和mTORC2活性,Western blot檢測(cè)各組mTORC1和mTORC2信號(hào)通路活性,同時(shí)利用ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液中甘油三酯(TG)、軟脂酸(PA)、二十二碳六烯酸(DHA)含量;其次,一方面利用mTORC1特異性抑制劑rapamycin處理細(xì)胞,抑制mTORC1信號(hào)通路活性,并利用RNA干擾技術(shù)靶向沉默mTORC1核心組分raptor基因來(lái)抑制mTORC1活性;另一方面靶向沉默mTORC2核心組分rictor基因來(lái)抑制mTORC2活性。利用Western blot檢測(cè)各組mTORC1和mTORC2信號(hào)通路活性,同時(shí)利用ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液中甘油三酯(TG)、軟脂酸(PA)、二十二碳六烯酸(DHA)含量,再利用質(zhì)譜檢測(cè)rapamycin處理組,rictor基因沉默組胞內(nèi)各類脂肪酸的含量;最后,對(duì)比在mTORC1和mTORC2都被抑制的情況下和mTORC1、mTORC2分別被抑制情況下TG、PA、DHA含量變化,對(duì)比分析mTORC1和mTORC2在乳脂合成中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:1)用AZD8055處理細(xì)胞后,MTT法檢測(cè)顯示100 nM AZD8055 處理 12h,100nM AZD8055 處理 24h,200nM AZD8055 處理 12h和200 nM AZD8055處理24 h時(shí)均可抑制細(xì)胞增殖,其中200 nM處理24 h組效果最顯著(p0.05);Western blot結(jié)果顯示,用AZD8055處理細(xì)胞后,mTORC1和mTORC2活性均被抑制(p0.05);ELISA結(jié)果顯示對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)液中的 TG、PA 和 DHA 含量分別為 19.26±0.85 mmol/L、28.89±1.59 ng/ml和 258.75 ±22.1 pg/ml,100 nM AZD8055 處理 24 h 組細(xì)胞培養(yǎng)液中 TG、PA 和DHA 含量分別為 16.07±2.05 mmol/L、22.68±3.2 ng/ml 和 188.63±14.57 pg/ml,200 nM AZD8055處理12 h組細(xì)胞培養(yǎng)液中TG、PA和DHA含量分別為14.74±2.61mmol/L、19.54±1.53ng/ml 和 183.82±26.94pg/ml。和對(duì)照組相比,處理組細(xì)胞培養(yǎng)液中TG、PA和DHA含量均顯著降低(p0.05);2)利用rapamycin處理抑制mTORC1活性,對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)液中的TG、PA和DHA含量分別為 5.42±0.08mmol/L、2.74±0.13ng/ml 和 403.3±11.17pg/ml,細(xì)胞內(nèi)31種脂肪酸總量3070.54±105.07 mg/kg;100 nM rapamycin處理8 h組細(xì)胞培養(yǎng)液中 TG、PA 和 DHA 含量分別為 4.53±0.13 mmol/L、2.74±0.13 ng/ml 和297.82±20.8pg/ml,細(xì)胞內(nèi) 31 種脂肪酸總量 2844.23±282.92 mg/kg。和對(duì)照組相比,處理組細(xì)胞培養(yǎng)液中TG、PA和DHA含量均顯著降低(p0.05),細(xì)胞內(nèi)31種脂肪酸總量降低,但差異不顯著(P0.05);3)靶向siRNA沉默Raptor基因,抑制mTORC1活性,對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)液中的TG、PA和DHA含量分別為 8.54±0.8 mmol/L、15.37±1.85 ng/ml 和 527.99±32.67 pg/ml,Raptor 基因沉默組細(xì)胞培養(yǎng)液中的TG、PA和DHA含量分別為6.56±0.42 mmol/L、11.07±1.46 ng/ml和331.84±48.02pg/ml。和對(duì)照組相比,處理組細(xì)胞培養(yǎng)液中TG、PA和DHA含量均顯著降低(p0.05);4)靶向siRNA沉默Rictor基因,抑制mTORC2活性,對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)液中的TG、PA和DHA含量分別為3.4±0.43 mmol/L、8.91±1.14ng/ml 和 109.47±7.46pg/ml,細(xì)胞內(nèi) 31 種脂肪酸總量 3070.54±105.07 mg/kg;Rictor基因沉默組細(xì)胞培養(yǎng)液中的TG、PA和DHA含量分別為2.49±0.24 mmol/L、6.93±0.14 ng/ml 和 55.74±6.01 pg/ml,細(xì)胞內(nèi) 31 種脂肪酸總量3028.66±120.05mg/kg。和對(duì)照組相比,處理組細(xì)胞培養(yǎng)液中TG、PA和DHA含量均顯著降低(b0.05),細(xì)胞內(nèi)31種脂肪酸總量降低,但差異不顯著(P0.05);5)三種方法對(duì)比mTORC1和mTORC2在TG、PA和DHA合成中的作用。一方面根據(jù)TG、PA和DHA抑制率分析,對(duì)TG、PA和DHA合成的作用mTORC2mTORC1;另一方面綜合考慮通路活性以及TG、PA和DHA 抑制率,對(duì) TG 和 DHA 作用 mTORC2mTORC1,對(duì) PA 作用 mTORC1mTORC2.綜上所述,mTORC1和mTORC2均在奶牛乳腺上皮細(xì)胞甘油三酯和脂肪酸合成中發(fā)揮作用。利用不同的方法對(duì)比分析mTORC1和mTORC2的作用強(qiáng)度,mTORC2的作用可能強(qiáng)于mTORC1。由于mTORC1和mTORC2兩條信號(hào)通路具有"串話(cross talking)"機(jī)制,二者在乳脂合成中的協(xié)調(diào)機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。
[Abstract]:In this study , mTORC1 and mTORC2 were used to study the activity of mTORC1 and mTORC2 . mTORC1 and mTORC2 were used to detect the activity of mTORC1 and mTORC2 . 1 ) After treated with AZD8055 , MTT assay showed that the contents of TG , PA and DHA in the treated group were respectively 14.74 鹵 2.61mmol / L , 28.89 鹵 1.59ng / ml and 188.63 鹵 14.57 pg / ml and 188.63 鹵 14.57 pg / ml and 188.63 鹵 14.57 pg / ml , respectively . The results showed that the contents of TG , PA and DHA in the treated group were respectively 14.74 鹵 2.61mmol / L , 19.54 鹵 1.53ng / ml and 183.82 鹵 26.94pg / ml , respectively . The contents of TG , PA and DHA in the culture fluid of treated group were 4.53 鹵 0.13 mmol / L , 2.74 鹵 0.13ng / ml and 297.82 鹵 20.8pg / ml , respectively . The contents of TG , PA and DHA were 2.49 鹵 0.24 mmol / L , 6.93 鹵 0.14 ng / ml and 55.74 鹵 6.01 pg / ml , respectively .
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S823

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本文編號(hào)：2124616