【摘要】：胚胎著床期妊娠障礙是導致奶牛繁殖失敗的最主要原因之一。胚胎植入和胚胎的早期發(fā)育是妊娠過程中最為關鍵的因素,胎盤作為聯(lián)系母體與胎兒的母胎界面,可通過在滋養(yǎng)層細胞和相關組織表達某些免疫因子來保護胎兒免受母體免疫系統(tǒng)的排斥,即免疫耐受,這種免疫耐受即妊娠的建立與維持依賴于MHC-I的正確表達。牛MHC-I稱為Bo LA-I,具有高度多態(tài)性,其經(jīng)典(Bo LA-Ia)和非經(jīng)典的I類(Bo LA-Ib)分子均于特定時期在牛胚胎滋養(yǎng)層和子宮內(nèi)膜上皮細胞中表達且與妊娠免疫密切相關。IFN-τ于胚胎植入期由胚胎滋養(yǎng)層細胞分泌,為反芻動物妊娠識別因子,可上調(diào)表達Bo LA-I重鏈,對胚胎植入有一定的調(diào)節(jié)作用。mi RNA是一類短的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA,長度約為22 nt,能與靶m RNA結合位點互補配對來調(diào)節(jié)基因的表達。mi RNA在許多細胞活動的調(diào)節(jié)過程中具有關鍵作用,也有研究發(fā)現(xiàn)mi RNA參與MHC-I的蛋白表達,但目前關于其在IFN-τ調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜上皮細胞中Bo LA-I表達的過程中發(fā)揮的作用還不了解。本試驗以分離培養(yǎng)的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞為基礎,采用200ng/m L IFN-τ作用于細胞;通過高通量測序技術獲得IFN-τ處理不同時間的細胞中mi RNA的表達情況,篩選出差異表達的mi RNA,同時預測差異表達mi RNA的靶基因;對其靶基因進行基因功能注釋(GO)和信號通路注釋(Pathway)分析,以期預測與IFN-τ調(diào)節(jié)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞差異表達Bo LA-I相關的重要mi RNA,為進一步研究奶牛妊娠免疫機制提供試驗依據(jù)。本研究主要結果如下:1.奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞總RNA的制備及質(zhì)檢本實驗設定200ng/m L IFN-τ作用于奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞,時間分別為0h、6h和12h,并分別設置各時間的對照組,提取各組細胞總RNA,通過1%瓊脂糖凝膠電泳、Nanodrop超微量分光光度計、Qubit 2.0 Fluorometer熒光計、Agilent 2100檢測各組樣品總RNA的降解程度、純度、完整性等,結果表明各組樣品總RNA純度高、完整性好、無明顯蛋白污染,符合建庫要求。2.奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞mi RNA測序分析以上樣品用于構建c DNA文庫,文庫經(jīng)質(zhì)檢合格后即按照數(shù)據(jù)量需求進行RNA-seq測序,分析mi RNA在各組樣品中的表達模式。通過對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估發(fā)現(xiàn),各組樣品RNA文庫中堿基錯誤識別率均為0.01%,GC含量在47.34%~48.53%之間,位于正常范圍且較為均一。對原始測序序列過濾后,獲得的純凈序列占原始序列的比例位于97.38%~98.76%;對純凈序列進行長度分析發(fā)現(xiàn),在0h,22 nt所占比例最大,約為37.75%,在6和12h,23 nt占有的比例最大,約為42.72%。�；蚪M定位分析結果表明,各樣品RNA文庫中有約60%的序列能夠比對到�；蚪M,注釋較為完整�；谛蛄械耐葱院捅Ｊ匦�,本研究共鑒定出574個已知mi RNA,并發(fā)現(xiàn)109個新mi RNA。在已知mi RNA中,有338個在各時間的實驗組和對照組中都有表達,但表達量有差異;新發(fā)現(xiàn)的mi RNA表達量均較低,但有14個在所有樣品中有表達。對以上683個mi RNA進行表達分析發(fā)現(xiàn)bta-mi R-21-5p在各組中的表達量都是最高的,mir-148家族成員也在各組樣品中以中等豐度表達,而novel_1在109個新發(fā)現(xiàn)的mi RNA中表達量整體最高。另外,在以上683個mi RNA中共有464個差異表達的mi RNA,其中291個在各實驗組中均有差異表達,而有173個在各對照組差異表達。在差異表達的mi RNA中,bta-mi R-181c、bta-mi R-181d和bta-mi R-152與Bo LA-I相關,其中,bta-mi R-181c和bta-mi R-181d在6h和12h時間組均下調(diào)表達;各組bta-mi R-152的表達與0小時比較均表現(xiàn)為上調(diào)(除12h實驗組),但在6h實驗組中的表達量明顯低于6h對照組。結果說明IFN-τ下調(diào)了bta-mi R-152的表達。對差異表達的mi RNA進行靶基因預測和GO及KEGG通路分析發(fā)現(xiàn),這些靶基因主要被富集到代謝過程和催化活性等,也被顯著富集到免疫應答(immune response)和免疫過程(immune system process)。這些靶基因也有被富集到一些經(jīng)典的代謝通路,以及同種移植物排斥、自然殺傷細胞介導的細胞毒性等自體免疫相關通路。在富集到這些免疫相關的功能注釋和信號通路的靶基因中均包含Bo LA-I重鏈基因。以上結果說明IFN-τ可通過影響mi RNA調(diào)控多種基因,進而調(diào)節(jié)奶牛妊娠免疫。相關基因及其作用機制尚需要進一步的研究去驗證和闡明。結論:IFN-τ可通過影響bta-mi R-152等mi RNA調(diào)控Bo LA-I重鏈的表達。
[Abstract]:In this study , the expression of mi - RNA in bovine endometrium epithelial cells was studied by means of high - throughput sequencing . The results were as follows : 1 . The expression of the mRNA of Bo LA - I was detected by high - throughput sequencing . The results showed that the total RNA purity was high , the integrity was good , no significant protein contamination was found in each group . The results showed that there were about 60 % of the samples in each group . The expression of bta - mi R - 152 and bta - mi R - 181d were down - regulated in both 6h and 12h . The expression of bta - mi R - 152 in the experimental group was significantly lower than that in the control group . The results showed that IFN - 蟿 downregulated the expression of bta - mi R - 152 . The results showed that IFN - 蟿 downregulated the expression of bta - mi R - 152 . The results showed that IFN - 蟿 downregulated the expression of bta - mi R - 152 . These target genes were mainly enriched in metabolic process and catalytic activity , and were also significantly enriched to immune response and immune system process . Conclusion : IFN - 蟿 can regulate the expression of Bo LA - I heavy chain by affecting the mi RNA of bta - mi R - 152 . Conclusion : IFN - 蟿 can regulate the expression of Bo LA - I heavy chain by affecting the mi RNA of bta - mi R - 152 .
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S858.23

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本文編號：2124478