【摘要】：豬博卡病毒(PBo V)最早于2009年在瑞典被發(fā)現(xiàn),迄今為止,對于其傳播方式,侵染機制,及其基因組功能都不甚明了,但是世界各國學者在進行該病毒的流行病學調(diào)查時發(fā)現(xiàn),該病毒在PMWS患豬中陽性率較高。另外還有學者提出豬博卡病毒可能與呼吸道疾病病原共感染機體。目前大多認為其基因組編碼3個開放閱讀框(ORF)分別對應非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、抗原蛋白VP、和非結(jié)構(gòu)蛋白NP1,VP蛋白為豬博卡病毒主要的抗原蛋白,但變異性較高,非結(jié)構(gòu)蛋白NP1,編碼一個相對保守且高度磷酸化的非結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)。目前世界各國對該病毒的檢測也僅僅局限于一些不成熟的PCR檢測方法,并無血清學檢測方法的問世,因而有效的血清學診斷方法的研究迫在眉睫,本研究成功的在河北地區(qū)病豬體內(nèi)提取出豬博卡病毒基因,分別對NP1基因和VP2基因進行B細胞線性抗原表位的預測分析,并對保守的NP1基因和截短的相對保守的VP2基因進行克隆表達,分別將純化的NP1蛋白和VP2截短蛋白作為包被抗原,經(jīng)過優(yōu)化條件和相對比較建立了快速檢測豬博卡病毒病的血清學診斷方法。根據(jù)NCBI系統(tǒng)中Gen Bank已發(fā)表的豬博卡病毒NP1和VP2基因序列,設計合成特異性引物,采用降落PCR技術(shù)擴增NP1基因和截短的VP2基因序列,克隆后進行測序,測序正確后進行克隆載體與加酶切位點的目的片段的連接轉(zhuǎn)化,并分別將質(zhì)粒命名為PMD-NP1和PMD-VP2。對重組質(zhì)粒PMD-NP1和PMD-VP2進行雙酶切得到帶酶切位點的NP1基因和截短的VP2基因并將其與原核表達載體p ET32a連接,構(gòu)建表達質(zhì)粒p ET32a-NP1和p ET32a-VP2。經(jīng)IPTG誘導后SDS-PAGE電泳可分別檢測到分子質(zhì)量約為44ku和35 ku的蛋白,與預期的蛋白分子量大小基本一致,以可溶性形式存在于上清中,同時在包涵體中也大量存在。利用原核表達載體p ET32a上帶有的His標簽對p ET32a-NP1和p ET32a-VP2重組蛋白進行純化,純化蛋白經(jīng)Western-blotting結(jié)果顯示,重組蛋白與PBOV陽性血清具有良好的反應原性。表明分子質(zhì)量約43 ku和37 ku的蛋白即為目的蛋白。以純化的兩種重組蛋白分別作為包被抗原,通過對各自反應條件的優(yōu)化,建立了檢測PBo V抗體的間接ELISA檢測方法,并比較兩種ELISA檢測方法。優(yōu)化結(jié)果顯示,以NP1蛋白為包被抗原的抗原最佳包被濃度為4μg/m L;封閉液為2%的明膠工作液;陰陽性血清最佳稀釋度為1∶80,二抗的最佳稀釋度為1∶1000,底物顯色時間為10 min。該方法與CSFV、PRRSV、PPV、PCV2陽性血清不發(fā)生交叉反應,批內(nèi)和批間重復性試驗的變異系數(shù)(CV)均值都小于10%,而以VP2蛋白為包被抗原的抗原最佳包被濃度為2μg/m L;封閉液為2%的明膠工作液;陰陽性血清最佳稀釋度為1∶80,酶標抗體最佳稀釋度為1∶1000,底物顯色時間為15 min。該方法與CSFV、PRRSV、PPV、PCV2陽性血清不發(fā)生交叉反應,批內(nèi)重復性試驗和批間重復性試驗的變異系數(shù)(CV)均小于10%,說明該方法具有較好的特異性和重復性,同時通過比較發(fā)現(xiàn)以NP1蛋白為包被抗原的ELISA方法比以VP2蛋白為包被抗原的ELISA方法檢出率高。
[Abstract]:The PBo V virus (PBo V) was first discovered in Sweden in 2009. So far, its transmission mode, infection mechanism, and its genome function are not very clear. However, in the epidemiological investigation of the virus, scholars from all over the world have found that the virus has a high positive rate in PMWS pigs. In addition, some scholars have suggested that the swine Boka virus can be used. The 3 open reading frames (ORF) are considered to correspond to the non structural protein NS1, the antigen protein VP, and the non structural protein NP1, and the VP protein is the main antigen protein of the porcine Boka virus, but the variability is high, and the non structural protein NP1 is encoded by a relatively conservative and highly phosphorylated protein. At present, the detection of the virus in the world is only limited to some immature PCR detection methods, and there is no serological detection method. Therefore, the effective serological diagnosis method is imminent. This study successfully extracted the porcine Boka virus gene in the infected pigs in Hebei area, and respectively to NP1 The gene and VP2 gene were used to predict the linear antigen epitopes of B cells and to clone and express the conservative NP1 gene and the truncated and relatively conservative VP2 gene. The purified NP1 protein and the VP2 truncated protein were used as the envelope antigen respectively. The rapid detection of the serological diagnosis of porcine Boka virus disease was established through the optimization conditions and relative comparison. Methods. Specific primers were designed and synthesized according to the NP1 and VP2 gene sequences of the porcine Boka virus published by Gen Bank in the NCBI system. The NP1 gene and the truncated VP2 gene sequence were amplified by landing PCR technique, and then sequenced and sequenced. The recombinant plasmid PMD-NP1 and PMD-VP2 were named PMD-NP1 and PMD-VP2., and the NP1 gene and the truncated VP2 gene with the enzyme cut site were obtained by double enzyme digestion, and they were connected with the prokaryotic expression vector p ET32a, and the expression plasmid P ET32a-NP1 and P ET32a-VP2. were constructed to detect the molecular mass of the molecular weight approximately and 35. Protein, in accordance with the expected protein molecular weight, exists in the soluble form in the supernatant and also exists in the inclusion bodies. The recombinant protein of P ET32a-NP1 and P ET32a-VP2 is purified by the His tag on the prokaryotic expression vector p ET32a. The purified protein is shown by Western-blotting, and the recombinant protein and PBOV Yang are shown. The sex serum has a good reactivity. It shows that the protein of about 43 Ku and 37 Ku is the target protein. The purified two recombinant proteins are used as the envelope antigen respectively. By optimizing the reaction conditions, the indirect ELISA detection method for detecting PBo V antibodies is established and two ELISA detection methods are compared. The optimization results show that The best envelope of antigen for NP1 protein was 4 mu g/m L and 2% gelatin working liquid in closed liquid; the optimum dilution of the sera was 1: 80, the best dilution of two resistance was 1: 1000, and the chromogenic time of the substrate was 10 min.. The method was not cross reacting with CSFV, PRRSV, PPV, PCV2 positive blood, and repeated test in batch and interbatch. The mean value of variation coefficient (CV) was less than 10%, and the best envelope of antigen with VP2 protein as antigen was 2 g/m L, and the closed liquid was 2% gelatin working liquid; the optimum dilution of the sera was 1: 80, the best dilution of the enzyme antibody was 1: 1000, and the chromogenic time of the substrate was 15 min.. The method did not exchange with the CSFV, PRRSV, PPV, and PCV2 positive serum. The coefficient of variation (CV) of the interbatch and interbatch repeatability test (CV) was less than 10%, indicating that the method had better specificity and repeatability. At the same time, it was found that the detection rate of the ELISA method with the NP1 protein as the envelope antigen was higher than the ELISA method with the VP2 protein as the envelope antigen.
【學位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.651

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本文編號：2122987