本文選題：輪狀病毒 + 全基因組分析�。� 參考：《揚州大學》2017年碩士論文

【摘要】：輪狀病毒(Rotavirus,RV)是人畜共患腹瀉的重要病原之一,其中豬輪狀病毒(Porcine Rotavirus,PoRV)是仔豬腹瀉的重要病因之一。該病流行范圍廣,發(fā)病率較高,若與豬流行性腹瀉病毒(PEDV)和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)混合感染會使病情加重,導致高死亡率,從而給畜牧業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。本論文就PoRV-GD-01-2015的全基因測序、抗PoRV的單克隆抗體的制備以及檢測PoRV的ELISA方法的建立三個方面展開研究,對PoRV疫苗的研發(fā)和致病機理的研究具有重要意義。1.PoRV-GD-01-2015的全基因序列分析本實驗將一份經(jīng)RT-PCR檢測豬輪狀病毒病原陽性的臨床腹瀉糞樣感染Vero細胞,成功分離到一株豬輪狀病毒GD-01-2015株;參照已發(fā)表的A組輪狀病毒CC0912-1設計合成11對引物,對GD-01-2015進行全基因克隆測序,并對其11個基因片段進行RotaC軟件分析、遺傳變異分析和生物信息學分析。結(jié)果顯示,GD-01-2015完整基因型為G5-P[7]-15-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1;GD-01-2015 與韓國毒株 K5 核酸同源性高達 99%;生物信息學分析預測發(fā)現(xiàn)各蛋白都具有良好的抗原性,其中VP1、VP3、VP4、VP7、NSP1、NSP2和NSP4屬于穩(wěn)定蛋白,VP7和NSP4分別含有2個和1個跨膜區(qū)結(jié)構(gòu),且VP7屬于疏水性蛋白。2.抗PoRV的單克隆抗體的制備將研究一中的PoRV-GD-01-2015感染Vero細胞,并將濃縮的含有PoRV-GD-01-2015的細胞液作為免疫原免疫小鼠,經(jīng)過兩次融合,以間接免疫熒光(IFA)方法為篩選方法,成功獲得兩株抗PoRV的單克隆抗體,并命名為PoRV-2F 10和PoRV-6F5。經(jīng)Western-Blot驗證所得單抗只識別病毒抗原。經(jīng)商品化試劑盒鑒定,所得兩株單克隆抗體的類型均為IgG,Kappa鏈。將兩株單抗制備腹水后,利用Protein G柱獲得了純化的抗體,為后續(xù)建立檢測方法奠定了基礎。3.雙夾心ELISA方法的建立通過相加ELISA方法確定PoRV-2F10和PoRV-6F5為針對不同抗原位點的兩株單克隆抗體。將兩株單克隆抗體進行交叉配對實驗,結(jié)果確定以PoRV-6F5為捕捉抗體,PoRV-2F10為酶標抗體建立了檢測PoRV的雙夾心ELISA方法;通過實驗條件的優(yōu)化,確定了捕捉抗體和酶標抗體的最佳工作濃度分別為3.5μg/mL和0.25μg/mL,待檢抗原和酶標抗體的最佳孵育時間均為60min,最佳顯色時間為20min;陽性臨界值的確定實驗結(jié)果顯示,當OD4500.165時判為陽性;利用本實驗建立好的雙夾心ELISA方法檢測PoRV,檢測到的最低抗原量為1.3X105個TCID5o;交叉反應性實驗結(jié)果顯示本實驗建立的雙夾心ELISA方法只與PoRV有陽性反應,與TGEV和PEDV無交叉反應,與陰性Vero細胞也無交叉反應,表明該方法具有較好的特異性;通過批間批內(nèi)重復實驗,發(fā)現(xiàn)該方法的批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均小于10%,說明該方法可行、重復性好。
[Abstract]:Rotavirus rotavirus (RV) is one of the most important pathogens of zoonotic diarrhea, among which porcine rotavirus (PoRV) is one of the important causes of piglet diarrhea. The disease has a wide epidemic range and a high incidence. If mixed with porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) and porcine infectious gastroenteritis virus (TGEV), the disease will be aggravated, resulting in a high mortality rate, thus causing serious economic losses to animal husbandry. In this paper, the whole gene sequencing of PoRV-GD-01-2015, the preparation of monoclonal antibody against PoRV and the establishment of Elisa for detecting PoRV were studied. The research and development of PoRV vaccine and the study of its pathogenic mechanism are important. 1. The whole gene sequence analysis of PoRV-GD-01-2015. In this experiment, a porcine rotavirus GD-01-2015 strain was isolated from Vero cells infected with fecal samples of clinical diarrhea positive for porcine rotavirus by RT-PCR. According to the published group A rotavirus CC0912-1, 11 pairs of primers were designed and synthesized. The GD-01-2015 gene was cloned and sequenced, and its 11 gene fragments were analyzed by RotaC software, genetic variation analysis and bioinformatics analysis. The results showed that the complete genotype of GD-01-2015 was G5-P [7] -15-R1-C1-M1-A1-T1-E1-H1-2015 and the nucleic acid homology of GD-01-2015 was 99% with Korean strain K5. Bioinformatics analysis predicted that all proteins had good antigenicity. VP1, VP3, VP7, NSP2 and NSP4 belong to stable protein, VP7 and NSP4, respectively. VP7 and NSP4 have two and one transmembrane structure respectively, and VP7 belongs to hydrophobic protein. The preparation of monoclonal antibody against PoRV will be used to infect Vero cells with PoRV-GD-01-2015, and the concentrated cell fluid containing PoRV-GD-01-2015 will be used as immunogen to immunize mice. After twice fusion, indirect immunofluorescence (IFA) method will be used as the screening method. Two monoclonal antibodies against PoRV were successfully obtained and named PoRV-2F10 and PoRV-6F5. The McAbs identified by Western-Blot only recognize viral antigens. The two McAbs were identified as IgG Kappa chain by commercial kit. After two McAbs were used to prepare ascites, the purified antibody was obtained by protein G column, which laid a foundation for the further establishment of detection method. 3. Establishment of double Sandwich Elisa method PoRV-2F10 and PoRV-6F5 were identified as two monoclonal antibodies against different antigen sites by additive Elisa. Two monoclonal antibodies were cross-matched. The results showed that a double sandwich Elisa method was established to detect PoRV by using PoRV-6F5 as capture antibody and PoRV-2F10 as enzyme labeled antibody. The optimal working concentration of capture antibody and enzyme labeled antibody were 3.5 渭 g / mL and 0.25 渭 g / mL, respectively. The optimal incubation time of antigen and enzyme labeled antibody were both 60 min and 20 min, and the positive critical value was determined when OD4500.165 was positive. The results of cross-reactivity test showed that the double sandwich Elisa method was only positive with PoRV, but not with TGEV and PEDV, and the results of cross-reactivity test showed that the double sandwich Elisa method had only positive reaction with PoRV, and had no cross reaction with TGEV and PEDV, and the results of cross-reactivity test showed that the double sandwich Elisa method was only positive for PoRV, and had no cross reaction with TGEV and PEDV. There was no cross reaction with negative Vero cells, which showed that the method had good specificity, and the coefficient of variation was less than 10% in both batches and batches, which indicated that the method was feasible and reproducible.
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.65

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本文編號：2113486