本文選題：豬圓環(huán)病毒型 + 交叉引物��； 參考：《畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)》2016年09期

【摘要】：擬建立一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的現(xiàn)場(chǎng)快速分子檢測(cè)方法,為豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)疾病的生物安全防控提供技術(shù)支撐。采用交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理,根據(jù)PCV2 Cap基因設(shè)計(jì)一組交叉擴(kuò)增引物,用構(gòu)建的Cap基因重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)DNA模板,對(duì)反應(yīng)體系的引物濃度、Betaine、MgSO4、dNTP、Bst酶、反應(yīng)溫度和時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,并結(jié)合核酸試紙條技術(shù),建立可視化檢測(cè)PCV2的交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法(PCV2-CPA)。用建立的CPA檢測(cè)方法、常規(guī)PCR和ELISA方法檢測(cè)經(jīng)IFA方法標(biāo)定的127份臨床樣品,比較這些方法的敏感性、特異性和符合率。結(jié)果顯示,最佳反應(yīng)體系為引物F3、B3各0.5μmol·L-1,CPR 1μmol·L-1,DF5F0.7μmol·L-1、DF5B0.9μmol·L-1,Betaine 0.075mol·L-1,MgSO43mol·L-1,dNTPs 0.4mmol·L-1,Bst DNA聚合酶9.6U。建立的檢測(cè)方法58℃擴(kuò)增50min,檢測(cè)限可達(dá)7.6拷貝·μL-1,靈敏度是常規(guī)PCR的10倍;與PCV1、PRV、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV和RV無交叉反應(yīng)。三種檢測(cè)方法的敏感性分別為78.08%~94.52%,特異性為87.03%~92.59%,符合率為84.25%~91.34%,ROC曲線圖顯示三種檢測(cè)方法中,CPA檢測(cè)方法效能最優(yōu)。建立的豬圓環(huán)病毒2型交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法不需要PCR儀,僅一臺(tái)水浴鍋或金屬浴即可完成病毒DNA的擴(kuò)增,密閉的核酸檢測(cè)試紙條使結(jié)果判定直觀、客觀,且可有效避免氣溶膠污染,可應(yīng)用于豬圓環(huán)病毒2型的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
[Abstract]:To establish a simple, rapid and accurate in situ rapid molecular detection method for the prevention and control of porcine circovirus type 2 (PCV2) disease. A set of cross amplified primers was designed according to PCV2 Cap gene by using the principle of cross primer constant temperature amplification. The recombinant plasmid Cap was used as standard DNA template to optimize the reaction temperature and time of the reaction system. Combined with nucleic acid test strip technique, a cross-primer isothermal amplification method (PCV2-CPA) for visual detection of PCV2 was established. The sensitivity, specificity and coincidence rate of these methods were compared with the established CPA assay, routine PCR and Elisa methods for the detection of 127 clinical samples calibrated by IFA method. The results showed that the best reaction system was: primer F3OB3 0.5 渭 mol L-1CPR1 渭 mol L-1F0.7 渭 mol L-1 DF5B0.9 渭 mol L-1n betaine 0.075mol L-1MgSO43mol L-1dNTPs 0.4mmol L-1Bst polymerase 9.6U. The method was amplified at 58 鈩，

本文編號(hào)：2084263