本文選題：雞 + piRNAs�。� 參考：《揚(yáng)州大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：生殖系細(xì)胞擔(dān)負(fù)著遺傳信息的世代傳遞,其基因組特性、表達(dá)與調(diào)控模式對個體及物種維持都至關(guān)重要。作為一半的遺傳信息載體的精子在家禽中一直未受到足夠關(guān)注。但是近年來,雞繁殖力持續(xù)下降的問題始終困擾著產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。地方雞種中每年有5～12%的公雞因精子發(fā)生障礙癥而遭淘汰。在現(xiàn)代商業(yè)品種中,種公雞的精子質(zhì)量導(dǎo)致出苗率逐年下降。另外,由精子介導(dǎo)的細(xì)菌微生物(白痢沙門氏菌、空腸彎曲桿菌等)與病毒性疾病(禽白血病、EDS-76等)逐年上升,其中,困擾產(chǎn)業(yè)多年的“兩白”(白痢與白血病)至今尚未解決。因此,研究雞精子發(fā)生及其影響機(jī)制成為當(dāng)下迫切解決的問題之一。piRNA(Piwi-interacting RNA)是一類長度約為30 nt左右的小RNA,與PIWI蛋白家族成員結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。在小鼠、果蠅、斑馬魚等模式動物中,PIWI/piRNAs復(fù)合物引起的基因沉默能調(diào)控生殖干細(xì)胞增殖、分化以及精子發(fā)生;但在家禽中,PIWIpiRNAs的研究報(bào)道甚少,其具體作用與功能尚未闡明。鑒于此,本研究以中國地方雞種——狼山雞為對象,分別從精子發(fā)生的不同階段生殖系細(xì)胞small RNAs表達(dá)譜、與雞PIWI蛋白特異結(jié)合的piRNAs表達(dá)與分析、piRNAs與靶基因的作用關(guān)系、減數(shù)分裂中Piwi基因作用及敲除Piwi基因后個體精子發(fā)生變化等方面來揭示家禽精子發(fā)生過程中Piwi基因與piRNAs的可能作用與具體功能,從而為探明Piwi基因及piRNAs在禽類中的生物學(xué)功能與改善家禽繁殖力提供理論依據(jù),也為豐富生殖細(xì)胞和精子發(fā)生的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制研究增添新的資料。為探究參與雞精子發(fā)生及生殖干細(xì)胞增殖相關(guān)的piRNAs,本研究利用深度測序技術(shù)獲得不同生殖干細(xì)胞(PGCs、SSCs)與生精細(xì)胞(Sa、Sperm)的small RNAs表達(dá)譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn),雞piRNAs主要集中在31～33nt之間,比小鼠中的piRNAs略長,主要定位于編碼基因序列及轉(zhuǎn)座子區(qū)域;堿基偏好性分析表明雞piRNAs均表現(xiàn)出首堿基為U,第10位為A(1U-10A)的特征,并且Sa細(xì)胞與Sperm中piRNAs的堿基偏好性更為明顯。另外,在Sa細(xì)胞及Sperm中預(yù)測到大量piRNAs簇,分別定位于不同染色體中。由此推測雞的piRNAs與小鼠piRNAs類似,對于精子發(fā)生有重要調(diào)控作用。通過不同生殖系細(xì)胞的單獨(dú)比較以及組間比較(PGCs vs.SSCs;Sa.vs.Sperm)富集到一批與雞精子發(fā)生及生殖干細(xì)胞增殖相關(guān)的piRNAs及其靶基因。對靶基因進(jìn)行GO富集后得到5個候選靶基因:尤IT,SMAD6,SCX,PGR和 GGNBP2。與這些靶基因?qū)?yīng)的 piRRNAs 有:piR-gga-19128(KIT),piR-gga-403821(SMAD6,SCX),piR-gga-123686(PGR),piRNA-396(GGNBP2)。同時,通過KEGG富集到的信號通路有:Melanogenesis,Notch signaling pathway,Steroid hormone biosynthesis,Cytokine-cytokine receptor interaction,Wnt signaling pathway 與 TGF-beta signaling pathway。為驗(yàn)證禽類piRNAs與PIWI蛋白結(jié)合狀況以及共同參與雞精子發(fā)生及生殖干細(xì)胞增殖、分化的可能作用,本研究利用免疫沉淀技術(shù)結(jié)合深度測序技術(shù)獲得PGCs、SSCs與Sperm的small RNAs表達(dá)譜。長度分析表明,與PIWIL1蛋白結(jié)合的piRNAs主要集中于31～33nt;堿基偏好性同樣表現(xiàn)為“1U-10A”特征,并且Sperm中的堿基偏好性比PGCs、SSCs明顯,上述分析結(jié)果均與前期研究結(jié)果一致,由此表明,雞piRNAs確實(shí)與PIWI蛋白相互結(jié)合并共同參與調(diào)控雞精子發(fā)生與生殖干細(xì)胞增殖與分化。通過三種細(xì)胞的venn分析篩選出一批與PIWI蛋白結(jié)合且參與精子發(fā)生及生殖干細(xì)胞增殖的piRNAs:piRNA-19128、piRNA-70672,piRNA-64217,piRNA-139648。通過靶基因注釋及GO富集分析獲得候選靶基因有:KIT、SRC、WNT4、HMGB2。KEGG富集分析獲得以下信號通路:Steroid hormone biosynthesis,Notch signaling pathway,Melanogenesis.綜合以上兩部分piRNAs的分析結(jié)果,通過Venn分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)piRNA-19128為二者交集,因此選取piRNA-19128為雞關(guān)鍵piRNAs進(jìn)行功能驗(yàn)證。研究表明KIT基因參與精子發(fā)生過程,并且對減數(shù)分裂發(fā)揮重要調(diào)控作用。因此,選取piRNA-19128對應(yīng)的靶基因KIT作為候選功能驗(yàn)證對象。為進(jìn)一步驗(yàn)證piRNAs與KIT基因的靶向調(diào)控關(guān)系,首先利用RT-qPCR技術(shù)檢測了 PGCs、SSCs、Sa及Sperm中KIT與piRNA-19128的表達(dá)量,結(jié)果表明,在SSCs與Sperm中,KIT基因表達(dá)量相對較高,但piRNA-19128表達(dá)量相對較低;l在PGCs及Sa中piRNA-19128表達(dá)量相對較高,但KIT基因表達(dá)量相對較低,且均達(dá)到顯著差異水平(P0.01)。由此推測,piRNA-19128與KIT基因可能存在靶向抑制關(guān)系。其次,利用piRNAs-19128模擬物與抑制物結(jié)合RT-qPCR技術(shù)檢測piRNA-19128的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染piRNA-19128 mimics與inhibitor至DF-1細(xì)胞后,隨mimics的轉(zhuǎn)染濃度增加,piRNA-19128的表達(dá)量隨之增加,KIT基因表達(dá)量隨之降低;隨inhibitor的轉(zhuǎn)染濃度增加,piRNA-19128的表達(dá)量隨之降低,KIT基因表達(dá)量隨之增加。雙熒光素酶熒光活性檢測進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),突變型KIT基因熒光活性與野生型熒光活性相比,突變型顯著高于野生型(P0.01)。綜上表明,piRNA-19128與KIT基因確實(shí)存在靶向調(diào)控關(guān)系,并且piRNA-19128抑制KIT基因的轉(zhuǎn)錄,從而參與精子發(fā)生過程中的減數(shù)分裂。為探明PIWI蛋白與piRNAs如何調(diào)控雞精子發(fā)生,我們選擇精子發(fā)生過程中關(guān)鍵事件—減數(shù)分裂作為功能研究平臺,探討編碼雞PIWI蛋白的Piwill(Piwi like-1)基因、KIT基因與piRNA-19128在減數(shù)分裂中的作用。本研究利用維甲酸誘導(dǎo)PGCs細(xì)胞,通過RT-qPCR、Western Blot及流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測誘導(dǎo)過程中PiwillmRNA及蛋白水平的變化。有研究表明,Piwil1基因在圓形精細(xì)胞中表達(dá)量最高,精原細(xì)胞次之,推測Piwil1基因參與減數(shù)分裂,并發(fā)揮重要調(diào)控作用。分別收集誘導(dǎo)48h、96h、144h的樣品,通過檢測減數(shù)分裂標(biāo)志基因Stra8的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨誘導(dǎo)時間的增加,Stra8基因的表達(dá)量顯著增加;流式分析誘導(dǎo)144h的細(xì)胞,表明44.9%的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,由二倍體變?yōu)閱伪扼w,由此推斷細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂狀態(tài)。通過檢測不同時間點(diǎn)Piwill基因、KiT基因與piRNA-19128的表達(dá)量,表明隨誘導(dǎo)時間的增加,Piwil1、KIT、piRNA-19128的表達(dá)量增加;PIWIL1蛋白水平檢測表明,隨誘導(dǎo)時間的增加,PIWIL1蛋白表達(dá)增加。由此推斷,在禽類中,Piwil1基因、KIT基因與piRNA-19128參與雞精子發(fā)生過程并調(diào)控減數(shù)分裂。為闡明PIWI/piRNAs復(fù)合物在家禽(雞)精子發(fā)生的具體功能,本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)在體內(nèi)、體外水平分別對Piwil1基因進(jìn)行敲除。首先針對Piwil1基因第八外顯子分別構(gòu)建3條敲除載體,通過轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞后使用T7E1酶切及PCR擴(kuò)增、測序表明2號位點(diǎn)可發(fā)揮敲除活性。利用有活性載體轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞,結(jié)合有限稀釋法得到58株單克隆細(xì)胞,PCR擴(kuò)增靶位點(diǎn)測序表明2株細(xì)胞為陽性細(xì)胞,一株共缺失23 bp,另一株共缺失8 bp。由此表明,利用該技術(shù)成功構(gòu)建Piwil1敲除細(xì)胞株,敲除效率為3.44%,略低于大鼠的敲除效率。在體內(nèi)水平,利用胚下腔注射法將敲除載體導(dǎo)入孵化2.5日齡的雞胚個體,分別檢測5日齡(心臟、生殖嵴)及18日齡(心臟、睪丸)不同組織中Piwil1基因DNA及RNA水平的突變情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在5日齡及18日齡的各個組織中,敲除位點(diǎn)附近均出現(xiàn)不同程度的突變。RT-qPCR結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組中Piwil1基因及SOX2基因表達(dá)水平顯著低于對照組(P0.01),表明敲除載體成功導(dǎo)入雞胚個體發(fā)揮敲除作用。對敲除后F0代雛雞進(jìn)行飼養(yǎng)并檢測其體重及精子活力,結(jié)果顯示敲除組群體體重與對照組無差異(P0.05),表明敲除Piwil1基因?qū)�體體重?zé)o影響。精液品質(zhì)檢測表明敲除Piwil1基因后,雞精子活力、活率下降,云霧狀不明顯,精液量顯著減少。對F0代實(shí)驗(yàn)雞群進(jìn)行本交得到F1代,PCR擴(kuò)增靶位點(diǎn)并測序表明,10只個體發(fā)生Piwil1基因突變。綜上表明,在家禽中Piwil1基因參與精子發(fā)生,并在其中發(fā)揮重要的功能;CRISPR/Cas9技術(shù)適用于家禽基因組修飾,并且其修飾效果可遺傳。
[Abstract]:In order to study the effects of Piwi gene and pirRNAs on the proliferation , differentiation and spermatigenesis of reproductive stem cells , it is found that the expression of Piwi gene and pirRNAs in poultry has not yet been solved . In order to verify the binding status of piRNAs and PIWI protein and to participate in the proliferation and differentiation of reproductive stem cells , pir - gga - 403821 ( SMAD6 , SCX ) , piR - gga - 403821 ( SMAD6 , SCX ) , piR - gga - 403821 ( SMAD6 , SCX ) , piR - gga - 403821 ( SMAD6 , SCX ) , piR - gga - 123686 ( PCR ) , piRNA - 396 ( GGNBP2 ) were obtained . The expression of piRNA - 19128 was significantly higher than that of wild type ( P0.01 ) . The expression of Piwil1 gene , KIT and piRNA - 19128 in different tissues of poultry ( chicken ) was detected by using the technique of CRISPR / Cas9 . The results showed that the body weight of the knock - out group was not different from that of the control group ( P0.05 ) .
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S831

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本文編號：2083718