本文選題：藏系綿羊 + MSX2基因��； 參考：《西南民族大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：本研究對藏系綿羊同源異型基因家族成員MSX2基因的序列、組織表達(dá)譜及其對細(xì)胞內(nèi)信號分子表達(dá)的影響進(jìn)行分析,為進(jìn)一步研究MSX2基因?qū)Σ叵稻d羊毛囊發(fā)育等過程的影響奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)采集了母藏系綿羊(n=5)的心、肝、脾、肺、腎、皮膚和脂肪等組織,從皮膚中克隆了MSX2基因編碼區(qū)序列,并分析了其在不同組織的表達(dá);構(gòu)建了該基因的皮膚特異表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人毛囊內(nèi)根鞘細(xì)胞(Human hair inner root sheath cells,HHIRSC),再利用熒光定量PCR及Western blot技術(shù)檢測該基因下游靶基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)情況。本研究獲得的主要結(jié)果如下:1、克隆得到藏系綿羊MSX2基因編碼區(qū)序列,長度為804 bp。與預(yù)測的綿羊MSX2基因序列相比,編碼區(qū)有6個差異堿基,匹配序列相似性為99.25%,另外還有6個堿基缺失。藏系綿羊MSX2基因推導(dǎo)的氨基酸序列包含267個氨基酸,理論分子量為28.98 kD,預(yù)測的理論等電點(diǎn)與普通綿羊相同,均為10.32,但存在3個氨基酸差異,并缺失了連續(xù)2個氨基酸,序列相似性為98.88%。2、利用熒光定量PCR分析了MSX2基因在藏系綿羊心、肝、脾、肺、腎、皮膚和脂肪的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,皮膚中MSX2基因的表達(dá)量極顯著高于其他組織(P0.01),暗示MSX2基因可能與藏系綿羊毛發(fā)生長或性狀相關(guān)。3、以pCDsRed2-1真核載體為骨架,構(gòu)建了含KAP6.1皮膚特異啟動子的MSX2基因皮膚特異表達(dá)載體pCDsR-KM。將該真核表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)入人毛囊內(nèi)根鞘細(xì)胞,轉(zhuǎn)染效率為10%左右;用流式細(xì)胞術(shù)分選轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞,獲得了轉(zhuǎn)染MSX2基因的HHIRSC。4、熒光定量PCR檢測表明,在流式細(xì)胞儀篩選后的HHIRSC中,MSX2基因超表達(dá)約9000倍,而MSX2基因下游靶基因Lef1、Foxn1、Notch1和Notch2基因的mRNA水平均顯著上調(diào)。進(jìn)一步用Western blot檢測Notch1和Notch2蛋白的表達(dá)情況,證實(shí)這兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)量亦顯著上調(diào)。這些結(jié)果提示,MSX2基因有可能通過Wnt、Notch和MSX2/Foxn1/毛發(fā)角蛋白等信號通路,影響皮膚毛囊發(fā)生和周期性變化。
[Abstract]:In this study, the sequence, tissue expression profile of MSX2 gene member of homologous gene family of Tibetan sheep and its effect on intracellular signal molecule expression were analyzed. The results laid a foundation for further study on the effect of MSX2 gene on the development of Tibetan sheep hair follicles. The heart, liver, spleen, lung, kidney, skin and fat of female Tibetan sheep were collected, the sequence of MSX2 gene coding region was cloned from the skin, the expression of MSX2 gene in different tissues was analyzed, and the skin specific expression vector of the gene was constructed. Human hair inner root sheath cells (HHIRSC) were transfected into human hair follicle cells in vitro. The expression of the downstream target gene of HHIRSC was detected by fluorescence quantitative polymerase chain reaction and Western blot. The main results of this study were as follows: 1. The sequence of MSX2 gene coding region of Tibetan sheep was cloned and the length of MSX2 gene was 804 BP. Compared with the predicted sheep MSX2 gene sequence, there were 6 different bases in the coding region, the similarity of the matching sequence was 99.25 and there were 6 base deletions. The deduced amino acid sequence of MSX2 gene of Tibetan sheep contained 267 amino acids with a theoretical molecular weight of 28.98 KD. The predicted theoretical isoelectric point was the same as that of common sheep (10.32), but there were three amino acid differences and two successive amino acids were missing. The sequence similarity was 98.880.The expression of MSX2 gene in heart, liver, spleen, lung, kidney, skin and fat of Tibetan sheep was analyzed by fluorescence quantitative PCR. The results showed that the expression of MSX2 gene in skin was significantly higher than that in other tissues (P0.01), suggesting that MSX2 gene might be related to hair growth or traits of Tibetan sheep, and was based on pCDsRed2-1 eukaryotic vector. The skin specific expression vector pCDsR-KMof MSX2 gene containing KAP6.1 skin specific promoter was constructed. The eukaryotic expression vector was transiently transfected into human hair follicle root sheath cells, and the transfection efficiency was about 10%. HHIRSC.4 transfected MSX2 gene was obtained by flow cytometry and detected by fluorescence quantitative PCR. The overexpression of MSX2 gene in HHIRSC by flow cytometry was about 9000 fold, while the mRNA levels of Lef1Foxn1n1 Notch1 and Notch2 genes were significantly up-regulated in the downstream target genes of MSX2 gene, Lef1, Foxn 1, Notch1 and Notch2 genes. Furthermore, the expression of Notch1 and Notch2 proteins was detected by Western blot, and the expression of Notch1 and Notch2 proteins was also significantly up-regulated. These results suggest that the MSX2 gene may affect the occurrence and periodic changes of the skin hair follicles through signal pathways such as WnttNotch and MSX2 / Foxn 1 / hair keratin.
【學(xué)位授予單位】：西南民族大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S826

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本文編號：2082270