本文選題：小分子熱休克蛋白 + 熱休克轉(zhuǎn)錄因子　； 參考：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：動(dòng)物機(jī)體長(zhǎng)時(shí)間暴露于熱環(huán)境中而缺乏適當(dāng)?shù)慕禍卮胧⿻r(shí)可能會(huì)招致組織器官的損傷,甚至危及生命。而危及生命的病因通常與心臟的疾患存在明顯的關(guān)聯(lián)性,�？蓪�(dǎo)致心臟驟停、中風(fēng)等。然而,生物體內(nèi)也存在能夠承受惡劣環(huán)境和刺激而產(chǎn)生的一類起保護(hù)作用的熱休克蛋白(Heat Shock Proteins,HSPs),這種HSPs常常受到熱休克轉(zhuǎn)錄因子-1(Heat Shock Transcription Factor-1,HSF-1)的調(diào)控,以保持生物體內(nèi)Hsps的動(dòng)態(tài)平衡。Hsps的過表達(dá)對(duì)受應(yīng)激原刺激的動(dòng)物機(jī)體或細(xì)胞有保護(hù)作用,但Hsps過表達(dá)的程度以及如何能誘導(dǎo)Hsps過表達(dá)以應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐等問題仍不十分清楚。況且,由于研究對(duì)象體內(nèi)復(fù)雜的生物調(diào)節(jié)活動(dòng)以及活體研究過程中眾多環(huán)境因素的影響,使得研究結(jié)果難以真實(shí)反映Hsps改變與應(yīng)激損傷之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系,從而出現(xiàn)認(rèn)識(shí)上的偏差。所以,在活體和離體培養(yǎng)細(xì)胞上同時(shí)進(jìn)行Hsps隨應(yīng)激時(shí)間而呈現(xiàn)的變化規(guī)律研究,如hsps mRNA轉(zhuǎn)錄狀態(tài)、Hsps表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律與應(yīng)激損傷及其程度,對(duì)應(yīng)激性病理損傷、應(yīng)激性疾病發(fā)生機(jī)理的闡明和動(dòng)物抗應(yīng)激危害措施的提出等具有重要意義。為此,本文通過體內(nèi)、外對(duì)比的方式,首先建立了不同熱應(yīng)激時(shí)間的體內(nèi)、外大鼠心肌細(xì)胞模型,檢測(cè)不同時(shí)間熱應(yīng)激處理后,體內(nèi)、外大鼠心肌細(xì)胞的應(yīng)激性病理損傷情況,同時(shí)觀察熱休克蛋白Hsp27和αB-Crystallin及其相應(yīng)mRNA在心肌細(xì)胞中的定位和表達(dá)情況,探討小分子熱休克蛋白在大鼠心肌細(xì)胞中的作用。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究動(dòng)態(tài)觀察Hsp27和αB-Crystallin在48 h熱應(yīng)激過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化以及與熱休克轉(zhuǎn)錄因子Hsf-1之間的相互關(guān)系。將適應(yīng)性飼養(yǎng)5d后的60日齡SD大鼠(n=60)隨機(jī)分為6組,分別為對(duì)照組(0 min)和熱應(yīng)激組(20 min,40 min,60 min,80 min,100min熱應(yīng)激組),每組10只。除了對(duì)照組外,將其余各組大鼠立即置于預(yù)熱至42℃、相對(duì)濕度為55%～65%的人工氣候室內(nèi)。待到限定的熱應(yīng)激時(shí)間點(diǎn)時(shí),迅速斷頸處死大鼠,采取血液,分別檢測(cè)血清內(nèi)心肌損傷相關(guān)酶谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)含量,同時(shí)采取大鼠的心臟,一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定,用于組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測(cè),另一部分迅速置于液氮中保存,用于Western blot和熒光定量Real Time PCR檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果顯示,熱應(yīng)激大鼠在42℃環(huán)境下暴露20 min后,即出現(xiàn)出汗、飲水增加。熱應(yīng)激至60 min后,死亡率達(dá)5%。應(yīng)激時(shí)間延長(zhǎng)至80 min時(shí),死亡率為50%。而熱應(yīng)激至120 min后,大鼠死亡率達(dá)到100%;病理組織學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著熱應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng),大鼠心肌細(xì)胞的應(yīng)激性病理損傷程度逐漸加重,呈現(xiàn)由急性變性到細(xì)胞壞死的現(xiàn)象;Western Blot半定量檢測(cè)結(jié)果顯示,從熱應(yīng)激的20 min開始,αB-Crystallin蛋白的表達(dá)量呈現(xiàn)先下降、然后升高、再于熱應(yīng)激至60 min～100 min時(shí)下降為特征的波動(dòng);免疫組織化學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn),αB-Crystallin在各個(gè)熱應(yīng)激組以及對(duì)照組心肌細(xì)胞中均定位在細(xì)胞漿內(nèi),但從20 min熱應(yīng)激開始,αB-Crystallin在心肌細(xì)胞細(xì)胞漿中的密度n少,40 min熱應(yīng)激時(shí)有所增加,而從60min～100min的熱應(yīng)激期間,αB-Crystallin在心肌細(xì)胞細(xì)胞漿中的密度又明顯減少,顯示出與該蛋白定位相一致的結(jié)果。αB-Crystallin表達(dá)量高的熱應(yīng)激組大鼠心肌細(xì)胞的病理損傷較輕,而αB-Crystallin表達(dá)量少的熱應(yīng)激組大鼠心肌細(xì)胞則顯示出較為嚴(yán)重的病理損傷,說明αB-Crystallin表達(dá)量的多少與熱應(yīng)激心肌細(xì)胞的應(yīng)激性病理損傷的嚴(yán)重程度有相關(guān)性;Hsp27在大鼠心肌細(xì)胞中與αB-Crystallin的蛋白表達(dá)以及相應(yīng)的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)出一致的趨勢(shì),結(jié)果提示Hsp27和αB-Crystallin在熱應(yīng)激大鼠心肌細(xì)胞中可能發(fā)揮保護(hù)性作用。選取大鼠心肌母細(xì)胞系H9C2在含5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)于37℃下進(jìn)行傳代培養(yǎng),以1.0×106接種于細(xì)胞瓶中,待細(xì)胞融合率達(dá)到90%以上時(shí),將心肌細(xì)胞分成6組,分別為對(duì)照組(0 min)和熱應(yīng)激組(20 min,40 min,60 min,80 min,100 min熱應(yīng)激組)。除對(duì)照組外,將其余各組心肌細(xì)胞迅速置于預(yù)熱至42℃的含5%的CO2培養(yǎng)箱中,待熱應(yīng)激結(jié)束后,將其中一組心肌細(xì)胞以4%多聚甲醛固定,用于細(xì)胞病理學(xué)及免疫細(xì)胞熒:光檢測(cè);另外一組則于液氮中保存,用于Western Blot和Real Time PCR檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果顯示,20 min的熱應(yīng)激處理后,心肌細(xì)胞發(fā)生以細(xì)胞體積腫大為特征的急性變性,熱應(yīng)激40min后,心肌細(xì)胞呈現(xiàn)顆粒變性并出現(xiàn)細(xì)胞核固縮。80min～100 min熱應(yīng)激后,心肌細(xì)胞呈現(xiàn)顆粒變性和細(xì)胞腫脹為特征的病理變化。Western Blot半定量檢測(cè)結(jié)果顯示,熱應(yīng)激40 min～60 min,αB-Crystallin蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組,熱應(yīng)激80 min～100 min時(shí),αB-Crystallin蛋白表達(dá)含量出現(xiàn)升高。免疫熒光結(jié)果中αB-Crystallin的信號(hào)強(qiáng)弱也同樣證實(shí)了蛋白表達(dá)量改變的結(jié)果。不過,熱應(yīng)激80 min后,αB-Crystallin陽性信號(hào)不僅定位于心肌細(xì)胞漿中,也同樣可見于細(xì)胞核內(nèi),這與在體大鼠心肌細(xì)胞中蛋白的分布和表達(dá)趨勢(shì)略有不同,而且體內(nèi)、外心肌細(xì)胞的熱應(yīng)激病理損傷程度也不一致,離體心肌細(xì)胞中所呈現(xiàn)的應(yīng)激性病理損傷較輕微,可能與小熱休克蛋白的定位有關(guān)。而在H9C2細(xì)胞中,Hsp27的蛋白表達(dá)量水平和其相應(yīng)的mRNA水平在熱應(yīng)激處理后也基本呈現(xiàn)出與αB-Crystallin相一致的變化。盡管在體外培養(yǎng)細(xì)胞與生物整體心肌細(xì)胞中Hsp27和αB-Crystallin的表達(dá)趨勢(shì)各有不同,但總體變化趨勢(shì)是一致的,即Hsp27和αB-Crystallin不論從蛋白水平或mRNA水平上在體內(nèi)、外大鼠心肌細(xì)胞中都保持基本一致的表達(dá)趨勢(shì)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步利用蛋白相關(guān)性分析軟件STRING(Version 9.1)分析鼠原Hsp27和αB-Crystallin之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)其兩者擁有很高的共表達(dá)系數(shù)。通過體內(nèi)外對(duì)比的方法,初步發(fā)現(xiàn)體內(nèi)、外大鼠心肌細(xì)胞中Hsp27和αB-Crystallin在mRNA基因水平和蛋白水平上都可以被急性熱應(yīng)激所誘導(dǎo),且Hsp27和αB-Crystallin可能通過共表達(dá)的方式在大鼠心肌細(xì)胞中發(fā)揮其分子伴侶作用。本試驗(yàn)在成功建立原代培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞的熱應(yīng)激模型基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究了HSPs在熱應(yīng)激大鼠心肌細(xì)胞中的作用以及與HSF-1的相關(guān)性。將原代培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞在含5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)于37℃培養(yǎng)48 h,待細(xì)胞融合率達(dá)到90%以上時(shí),將心肌細(xì)胞分為熱應(yīng)激0min,10 min,20 min,40 min,60 min,120 min,240 min,360min和480 min組。待到限定的熱應(yīng)激時(shí)間點(diǎn)時(shí),收集各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液,用于心肌細(xì)胞損傷相關(guān)酶ALT、LDH、CK、CK-MB的含量檢測(cè);同時(shí)收集各組熱應(yīng)激心肌細(xì)胞,分別用于免疫細(xì)胞熒光、Western Blot、熒光定量RT-PCR檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果顯示,αB-Crystallin mRNA及hsp27 mRNA在熱應(yīng)激480min期間有顯著改變,二者的mRNA轉(zhuǎn)錄水平從熱應(yīng)激20 min起就開始出現(xiàn)極顯著地升高;Hsf-1在熱應(yīng)激至120 min后出現(xiàn)極顯著升高;Hsp90的表達(dá)呈現(xiàn)出與Hsf-1表達(dá)相一致的趨勢(shì),而Hsp70則呈現(xiàn)與Hsf-1相反的表達(dá)趨勢(shì)。利用STRING(version 9.1)蛋白分析軟件分析各種Hsps之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn),Hsf-1與Hsp90和Hsp70之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性,說明Hsf-1可能不參與調(diào)控小熱休克蛋白αB-Crystallin的表達(dá)。
[Abstract]:In this paper , the effects of heat shock protein Hsp27 and 偽 - B - allallin on stress - induced pathological injury in vivo and in vivo and in vitro were studied . 鐩稿婀垮害涓，

本文編號(hào)：2058830