本文選題：豬圓環(huán)病毒2型 + 豬鼻支原體��； 參考：《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2015年碩士論文

【摘要】：豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)是引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(Porcine circovirus-associated disease,PCVAD)的重要病原,對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬鼻支原體(Mycoplasma hyorhinis,Mhr)能夠感染不同年齡的豬,引起胸膜炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎、中耳炎、多發(fā)性漿膜炎及豬地方性肺炎(Swine enzootic pneumoniae,SEP),嚴(yán)重影響豬只生長性能。該病原體在臨床上常與PCV2、PRRSV等病原體混合感染,致使斷奶仔豬的死亡率顯著升高。目前Mhr和PCV2的共感染特性及其感染機制尚不清楚,闡明這兩種病原體協(xié)同感染對仔豬的致病性具有重要的臨床意義。本研究通過建立Mhr核酸、抗原和抗體等的檢測方法,利用實驗室分離的Mhr(DL株)與PCV2(PCV2b,YJ株)進(jìn)行了共感染試驗,旨在闡明這兩種病原體共感染對仔豬的致病性作用。第一、豬鼻支原體抗體間接ELISA檢測方法的建立及應(yīng)用。為了檢測豬血清中Mhr抗體水平,本研究采用脫氧膽酸鈉法(DOC)提取Mhr膜蛋白作為包被抗原,建立了用于Mhr血清抗體檢測的間接ELISA方法。其特異性為90.5%,敏感性為98.0%。除豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhyo)外,該方法與幾種豬病毒陽性血清及副豬嗜血桿菌IV型陽性參考血清均無交叉反應(yīng)。對Mhr-DL菌株感染巴馬豬血清抗體檢測表明,Mhr感染后第3 d血清抗體陽轉(zhuǎn),第35 d時抗體達(dá)到高峰,抗體效價為1:6400。用該方法與IDEXX肺炎支原體抗體檢測試劑盒平行檢測138份現(xiàn)地血清樣品,Mhr和Mhp陽性檢出率分別為71.0%和44.9%。對來自黑龍江、吉林、山東等地臨床送檢的457份血清檢測結(jié)果顯示,Mhr陽性率為70.3%,表明我國養(yǎng)豬群Mhr感染十分普遍。第二、抗Mhr膜蛋白的單克隆抗體制備及抗原表位的鑒定。本研究以DOC提取的Mhr膜蛋白免疫BALB/c小鼠,并通過淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)獲得了10株能夠穩(wěn)定分泌特異性抗DOC提取膜蛋白的雜交瘤細(xì)胞株,依次命名為1B4、1D2、1H8、1H12、2B6、2H2、3G2、3G10、4B7和4H2;MAb亞類鑒定除2H2為IgG2b亞型外均為IgG1亞型,輕鏈均為κ鏈;雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液上清效價為1:200~1:400,腹水效價為1:1.0×105~1:2.0×105;Western blot結(jié)果顯示,其中5株單克隆抗體針對Mhr同一種大小膜蛋白產(chǎn)生特異性反應(yīng)。經(jīng)質(zhì)譜分析、蛋白表達(dá)和Western blot鑒定該膜蛋白為Mhr丙酮酸脫氫酶E1復(fù)合體α亞基。為了對其抗原表位進(jìn)行鑒定,通過對Mhr丙酮酸脫氫酶E1復(fù)合體α亞基截短表達(dá)與人工合成肽相結(jié)合的方法對其表位進(jìn)一步分析,初步確定了3個抗原表位,分別為269SSDNPRIYRTEEEEK283,299KDKKYITDEEIKQIW313和350LKEQKQHAKDY360。第三、Mhr核酸檢測SYBR熒光定量PCR方法的建立及其應(yīng)用。為了檢測豬血液及組織中Mhr核酸載量,本研究參考GenBank發(fā)表的Mhr P37基因序列設(shè)計一對特異性引物,建立了一種能夠檢測Mhr核酸載量的特異性好、敏感性高的SYBR熒光定量PCR方法。該方法擴增效率為1.04,誤差值為0.0189,批內(nèi)變異系數(shù)小于2.0%。與常規(guī)PCR相比,本方法敏感性提高100倍以上。該方法與豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)、PCV2、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)和Mhyo均無交叉反應(yīng)。利用本試驗方法對Mhr-DL菌株經(jīng)氣管、腹腔和氣管+腹腔感染仔豬21 d后剖殺的各組織中Mhr核酸含量進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)Mhr核酸主要存在于扁桃體和肺臟中,且腹腔和氣管+腹腔感染組試驗豬Mhr核酸載量明顯高于氣管感染組和對照組。第四、PCV2和Mhr共感染試驗仔豬的協(xié)同致病性試驗。為了闡明PCV2和Mhr的協(xié)同致病作用及這兩種病原體不同時間順序共感染與其協(xié)同致病性之間的關(guān)系,試驗選用30日齡健康仔豬30頭,隨機分為6組(每組5頭),分別為Mhr-PCV2共感染組、Mhr/PCV2順序共感染組(感染Mhr 1 w后感染PCV2)、PCV2/Mhr順序共感染組(感染PCV2 1 w后感染Mhr)、Mhr單感染組、PCV2單感染組及對照組。臨床癥狀觀察發(fā)現(xiàn),感染后Mhr-PCV2、PCV2/Mhr、Mhr/PCV2共感染組和Mhr單感染組均能觀察到短暫的食欲不振、體溫升高、咳嗽、跛行和體重降低。血清抗體檢測結(jié)果表明,Mhr-PCV2、PCV2/Mhr和Mhr/PCV2共感染組中PCV2和Mhr抗體水平均不同程度高于單感染組和對照組。此外,Mhr-PCV2、PCV2/Mhr和Mhr/PCV2共感染組不同組織中PCV2和Mhr核酸含量、組織器官剖檢變化及肺部組織病理變化明顯高于單感染組和對照組。細(xì)胞因子檢測結(jié)果表明Mhr-PCV2共感染組中TNF-α、IL-2和IL-6水平明顯高于其他各試驗組。
[Abstract]:Mycoplasma hyorhinis ( Mhr ) was used to infect pigs with different ages . A novel SYBR fluorescence quantitative PCR ( SYBR ) method was established to detect Mhr ' s nucleic acid in pigs . The levels of IL - 2 and IL - 6 were significantly higher than those in other test groups .
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.28

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2041073