本文選題：PAR6 + 豬��； 參考：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：分離缺陷基因PAR6(partitioning defective 6)主要包括PARD6A、PARD6B和PARD6G三種亞型,最初是在秀麗線蟲中發(fā)現(xiàn)的,它們所編碼的PAR6蛋白是一種重要的極性分子,在果蠅、爪蟾、小鼠等生物體內(nèi)都有其同源物存在。為了探究其在豬卵母細胞體外成熟過程中的作用,本試驗首先采用RT-PCR技術(shù)從豬卵巢組織中克隆出了PARD6A、PARD6B基因,構(gòu)建了pPARD6A-Venus和pPARD6B-Venus真核表達載體,將構(gòu)建成功的載體轉(zhuǎn)染Hela細胞予以驗證;其次通過體外轉(zhuǎn)錄將pPARD6A-Venus和pPARD6B-Venus轉(zhuǎn)錄成為RNA,通過顯微注射技術(shù)分別將其注射到豬卵母細胞中,在體外培養(yǎng)成熟后統(tǒng)計第一極體排出率;再次,通過免疫熒光染色方法分別對豬卵母細胞GV、GVBD以及MⅡ期進行染色,探究PARD6A在豬卵母細胞成熟過程中的定位;最后,將PARD6A抗體顯微注射到豬卵母細胞中,體外成熟培養(yǎng)后統(tǒng)計第一極體排出率。研究取得如下結(jié)果:1.通過RT-PCR從豬卵巢組織中克隆出了PARD6A、PARD6B的CDS區(qū),并連接到p-Venus真核表達載體上,構(gòu)建pPARD6A-Venus和pPARD6B-Venus真核表達載體,經(jīng)過雙酶切鑒定后送測序公司測序,表明載體構(gòu)建正確。將該載體轉(zhuǎn)染到Hela細胞,發(fā)現(xiàn)其在Hela細胞中的表達,產(chǎn)物未表現(xiàn)出明顯的極性定位現(xiàn)象。2.通過體外轉(zhuǎn)錄將pPARD6A-Venus和pPARD6B-Venus真核表達載體轉(zhuǎn)錄成RNA,分別將兩種RNA顯微注射到GV期豬卵母細胞中,進行體外成熟培養(yǎng),觀察統(tǒng)計結(jié)果表明,兩者對豬卵母細胞的第一極體排出率均無顯著影響。3.通過對豬卵母細胞GV期、GVBD以及MII期的免疫熒光染色,發(fā)現(xiàn)PARD6A蛋白在豬卵母細胞第一次減數(shù)分裂過程中沒有表現(xiàn)出明顯的極性分布現(xiàn)象,并且其定位也沒有隨著豬卵母細胞的體外成熟過程發(fā)生明顯的變化。4.對豬卵母細胞顯微注射PARD6A的單克隆抗體之后,其第一極體排出率明顯下降。結(jié)論:成功構(gòu)建了pPARD6A-Venus和pPARD6B-Venus真核表達載體;過表達PARD6A或PARD6B對體外培養(yǎng)的豬卵母細胞的第一極體排出率無顯著影響;PARD6A在豬卵母細胞體外成熟過程中未表現(xiàn)出明顯的極性定位;干擾PARD6A蛋白會降低豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)時的第一極體排出率。
[Abstract]:The defect gene PAR6 partitioning defective 6 includes three subtypes, PARD6A, PARD6B and PARD6G. The PAR6 protein encoded by PAR6 protein is an important polar molecule and has its congeners in Drosophila, Xenopus claws and mice. In order to investigate its role in porcine oocytes maturation in vitro, the PARD6AhPARD6B gene was cloned from porcine ovarian tissue by RT-PCR, and the eukaryotic expression vectors pPARD6A-Venus and pPARD6B-Venus were constructed. Then pPARD6A-Venus and pPARD6B-Venus were transcribed into RNAs and injected into porcine oocytes by microinjection technique, and the first polar body excretion rate was calculated after maturation in vitro. Thirdly, the localization of PARD6A in the maturation process of porcine oocytes was investigated by immunofluorescence staining of GVV GVBD and phase M 鈪，

本文編號：2035364