本文選題：PID1 + 磁性納米顆粒�。� 參考：《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：養(yǎng)豬生產(chǎn)是世界動物產(chǎn)業(yè)的重要組成部分。隨著全球經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,豬肉品質(zhì)已經(jīng)引起了消費(fèi)者和生產(chǎn)者的廣泛重視。規(guī)模化養(yǎng)豬生產(chǎn)已經(jīng)造成肉質(zhì)變差,肌內(nèi)脂肪降低。肉質(zhì)是畜牧生產(chǎn)中最重要的經(jīng)濟(jì)性狀之一。提高豬肉品質(zhì),對于養(yǎng)豬業(yè)有著十分重要的意義。肌內(nèi)脂肪,即大理石紋,是影響肉質(zhì)的最重要指標(biāo)之一,影響肉的嫩度、多汁性以及口感。眾多研究結(jié)果表明:磷酸絡(luò)氨酸互作結(jié)構(gòu)域1(PID1)基因的表達(dá)與肌內(nèi)脂肪沉積有關(guān),PID1基因是脂肪沉積的候選基因。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到快速發(fā)展,它已經(jīng)是生產(chǎn)用于科研、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及疾病控制的基因修飾動物的一個(gè)非常有利的工具。精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因是基于精子細(xì)胞的特有能力來結(jié)合、內(nèi)化外源DNA,然后通過受精作用將其轉(zhuǎn)入卵內(nèi)。精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)與其他方法相比,有著高效率、低成本、簡便操作等主要優(yōu)勢,不需要胚胎操作或是昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備。磁性納米顆粒作為把藥物或基因轉(zhuǎn)染指定目標(biāo)細(xì)胞或組織的方法,已經(jīng)得到廣泛研究。磁性納米轉(zhuǎn)染是一種簡單、通用、高效的基因轉(zhuǎn)移方法。本試驗(yàn)中,PEI包被的磁性納米顆粒被用來作為基因轉(zhuǎn)移的介質(zhì)來轉(zhuǎn)染精子,之后,經(jīng)過轉(zhuǎn)染的精子用來介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因。我們獲得了PID1高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因豬,并進(jìn)行了檢測。主要結(jié)果如下:1.將實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建成功的pIRES2-AcGFP1-PID1真核表達(dá)載體與磁性納米顆粒polyMAG-1000室溫共孵育10 min,之后將磁性顆粒-質(zhì)�；旌衔锱c精液室溫共孵育30min,將轉(zhuǎn)染后的精液通過人工授精方式對3頭母豬進(jìn)行授精,生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬F0代。2.PCR和Southern blot被用來檢測外源基因。本試驗(yàn)F0代共獲得仔豬37頭,陽性個(gè)體(PCR和Southern blot共陽性)13頭,陽性率35.13%。其中,獲得24頭活仔豬,陽性個(gè)體7頭,陽性率29.16%。3.熒光定量PCR和Western blot檢測顯示目的基因PID1在轉(zhuǎn)基因陽性豬的表達(dá)要高于陰性豬。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在背最長肌組織和肝臟組織中,轉(zhuǎn)基因陽性豬PID1基因的表達(dá)量顯著高于陰性豬(P0.05);在背膘、腎臟組織中兩者表達(dá)差異不顯著(P0.05)。PID1蛋白的檢測結(jié)果與PID1的mRNA表達(dá)量的結(jié)果一致:背最長肌組織和肝臟組織中,陽性組與陰性組相比蛋白表達(dá)量顯著升高(P0.05)。4.建立利用SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR法來檢測轉(zhuǎn)基因豬外源基因整合拷貝數(shù)的方法。以4頭F0代試驗(yàn)豬為研究對象(2頭轉(zhuǎn)基因陽性豬,2頭陰性豬),以轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因?yàn)閮?nèi)參基因,通過SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR建立針對外源基因GFP和內(nèi)參基因的雙標(biāo)準(zhǔn)曲線和方程。對轉(zhuǎn)基因豬基因組DNA中外源基因和內(nèi)參基因的拷貝數(shù)同時(shí)定量檢測,外源基因與內(nèi)參基因起始模板拷貝數(shù)的比值即為外源基因在轉(zhuǎn)基因豬中的整合拷貝數(shù),同時(shí)利用Southern blot進(jìn)行驗(yàn)證分析。結(jié)果顯示,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測2頭轉(zhuǎn)基因陽性豬外源基因拷貝數(shù)分別為3和2,2頭轉(zhuǎn)基因陰性豬外源基因拷貝數(shù)均為0,結(jié)果同Southern blot檢測一致。本試驗(yàn)證明實(shí)時(shí)熒光定量PCR法高通量、靈敏、方便,可以更好的用于轉(zhuǎn)基因豬外源基因整合拷貝數(shù)的檢測。5.以4頭F0代試驗(yàn)豬為研究對象(2頭轉(zhuǎn)基因陽性豬,2頭陰性豬)進(jìn)行肉質(zhì)測定,結(jié)果顯示:在pH1,pH24、滴水損失、烹飪損失、肉中水分、干物質(zhì)方面,陽性豬與陰性豬相比較差異均不顯著(P0.05)。在剪切值上,陽性豬比陰性豬要大且差異顯著(P0.05)。肌內(nèi)脂肪含量陽性組顯著高于陰性組,差異顯著(P0.05),說明PID1基因與肌內(nèi)脂肪的沉積有關(guān)。
[Abstract]:Sperm mediated transgenosis is one of the most important economic characters in animal husbandry . A double standard curve and equation for exogenous gene GFP and internal reference gene were established by SYBR Green I real - time fluorescence quantitative PCR .
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S828

【二級參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2025818