本文選題：豬流行性腹瀉病毒 + 豬輪狀病毒��； 參考：《西北農(nóng)林科技大學》2017年碩士論文

【摘要】：豬病毒性腹瀉是我國豬場常見的多發(fā)病,其主要病原有豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬輪狀病毒(PRV)和豬傳染性腸胃炎病毒(TGEV)。該類疾病的傳染率和致死率都很高,同時各年齡階段的豬均有感染的危險,嚴重威脅了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,因此研究有效的相關疫苗具有重要意義。本試驗在前期關于PRV病毒VP7蛋白在煙草中表達的基礎上進行更深入的探索,以煙草瞬時表達系統(tǒng)、煙草穩(wěn)定表達系統(tǒng)和玉米胚乳特異性表達系統(tǒng)作為生物反應器,分別構建這幾種病毒相關抗原蛋白的重組表達載體,采用農(nóng)桿菌介導法轉入受體植物材料,并進行蛋白表達檢測,為進一步開發(fā)植物源病毒疫苗奠定基礎。試驗主要取得以下結果:(1)選取PEDV病毒纖突蛋白S上的主要抗原位點所在區(qū)域248-789位氨基酸,用煙草核偏愛密碼子進行優(yōu)化并由公司合成基因。根據(jù)受體植物材料不同,分別選取植物35S啟動子和玉米14kD Zein啟動子,成功構建了pBI121-S植物表達載體和pBI121-pZein::S玉米胚乳特異性表達載體。用電擊法將載體轉入農(nóng)桿菌GV3101中,再用農(nóng)桿菌侵染法構建植物轉基因再生體系,分別將S基因轉入普通煙草葉盤和玉米胚乳愈傷組織中。經(jīng)篩選和誘導培養(yǎng),獲得再生抗性植株。(2)以普通煙草為材料,用優(yōu)化的瞬時表達系統(tǒng)對PRV病毒中和抗原和血凝素抗原的融合蛋白VP4-7進行轉化,提取侵染后的煙草總蛋白并用鎳柱純化,純化前后的蛋白我們分別進行了SDS-PAGE和Western Blot分析。用His-tag抗體進行檢測,總蛋白Western的結果顯示目的蛋白獲得了表達,純化后的結果顯示蛋白的大小發(fā)生了變化。(3)選取TGEV病毒纖突蛋白S上的抗原位點所在區(qū)域1-543位氨基酸,用煙草核偏愛密碼子進行優(yōu)化并由公司合成基因。成功構建了pBI121-TS植物表達載體,為后續(xù)植物疫苗的研究奠定了基礎。
[Abstract]:Porcine viral diarrhea is a common disease in pig farms in China. The main pathogens are Porcine epidemic diarrhea virus (PEDVV), Porcine Rotavirus (PRV) and Porcine Infectious gastroenteritis virus (TGEV). The infection rate and fatality rate of this kind of disease are very high, and at the same time, pigs of all ages are at risk of infection, which seriously threatens the development of pig industry. Therefore, it is of great significance to study effective related vaccines. In this study, the expression of PRV VP7 protein in tobacco was further explored. Tobacco transient expression system, tobacco stable expression system and maize endosperm specific expression system were used as bioreactor. The recombinant expression vectors of these virus-associated antigen proteins were constructed, and then transferred to the recipient plant material by Agrobacterium tumefaciens, and the protein expression was detected, which laid a foundation for the further development of plant-derived virus vaccine. The main results were as follows: (1) the amino acids at the 248-789 amino acid site of the main antigen site of PEDV fibrin S were selected and optimized by tobacco nucleopolymeric codon and synthesized by the company. The plant expression vector pBI121-S and the specific expression vector pBI121-pZein: s of maize endosperm were successfully constructed by selecting plant 35s promoter and maize 14kD Zein promoter according to the different plant materials of the receptor. The plant expression vector pBI121-S and pBI121-pZein: 1: s maize endosperm specific expression vector were successfully constructed. The vector was transferred into Agrobacterium tumefaciens GV3101 by electric shock method, and then the transgenic regeneration system was constructed by Agrobacterium tumefaciens. The S gene was transferred into the leaf disk of common tobacco and the callus of maize endosperm, respectively. The regenerated resistant plant was obtained by screening and inducing culture. The recombinant protein VP4-7 of PRV neutralizing antigen and hemagglutinin antigen was transformed by the optimized transient expression system, using common tobacco as the material, and the fusion protein VP4-7 of PRV neutralizing antigen and hemagglutinin antigen was obtained. The total protein of infected tobacco was extracted and purified by nickel column. The protein before and after purification was analyzed by SDS-PAGE and Western blot, respectively. His-tag antibody was used to detect the protein. Western results of the total protein showed that the target protein was expressed. The purified protein showed that the size of the protein had changed.) the amino acid at the antigenic site of TGEV fibrin protein S was selected, and the amino acid at position 1-543 was selected. Tobacco nucleus preference codon is used to optimize and synthesize genes from companies. The plant expression vector pBI121-TS was successfully constructed, which laid a foundation for the further study of plant vaccine.
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.651

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本文編號：2023783