本文選題：水貂阿留申病毒 + CRFK細胞��； 參考：《吉林農業(yè)大學》2017年碩士論文

【摘要】：水貂阿留申病(Aleutian disease of mink,AMD),是危害世界養(yǎng)貂業(yè)的主要疾病之一,其病原為水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus,AMDV)感染表現(xiàn)為慢性、持續(xù)性、進行性感染,皮獸群毛皮質量下降,種獸群繁殖能力降低,又稱為漿細胞增多癥。由于該病致病機理特殊,目前仍未研制出有效疫苗用于防控該病。研究表明,AMDV的限制性低水平復制與表達,可以導致病貂的持續(xù)性感染和免疫復合物的形成,引發(fā)慢性疾病,而細胞凋亡在這一致病過程中發(fā)揮重要作用。通常體外連續(xù)培養(yǎng)病毒是研究病毒致病機理以及強毒致弱獲得弱毒疫苗侯選毒株最常規(guī)的方法。本試驗對實驗室分離鑒定的強毒株進行體外連續(xù)傳代培養(yǎng),對不同代次、不同毒力的病毒增殖特性及凋亡特性進行研究,為AMDV致病機理研究以及弱毒疫苗侯選毒株篩選奠定基礎。設計特異性引物,通過反應條件的優(yōu)化,建立了AMDV熒光定量PCR檢測方法,該方法具有較好的特異性、敏感性和重復性。為AMDV臨床檢測及AMDV在CRFK細胞的增殖評價提供技術支持。對實驗室分離鑒定的AMDV強毒株AMDV-DL124和AMDV-DL125株第7代(F7)細胞毒在CRFK細胞中進行體外培養(yǎng),通過培養(yǎng)條件優(yōu)化,目前已連續(xù)傳代至45代(F45)。通過病毒含量測定、間接免疫熒光試驗和熒光定量PCR試驗對AMDV-DL124、AMDV-DL125毒株F7代及F45代細胞毒和標準弱毒株AMDV-G株在CRFK細胞的增殖特性進行研究。結果表明,AMDV-DL124和AMDV-DL125株病毒F7代毒的病毒含量可達108.5 TCID50/mL、明顯高于F45代毒的病毒含量106 TCID50/mL和AMDV-G 105.5 TCID50/mL,而F45代毒和和AMDV-G株間,病毒含量無明顯差異;間接免疫熒光試驗結果表明,AMDV-DL124和AMDV-DL125株在48-72h增殖速度較快,在12-24h增殖速度較慢;熒光定量PCR試驗結果表明,隨著培養(yǎng)時間的延長AMDV在CRFK細胞的核酸量不斷增加,在感染后12h后增加明顯,但AMDV-DL124、AMDV-DL125核酸量的峰值可達2.4×106個拷貝,明顯高于F45代病毒和AMDV-G株病毒,而后二者之間無明顯差異。上述結果表明,AMDV強毒株AMDV-DL124和AMDV-DL125經CRFK細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代后在CRFK細胞的增殖能力降低。應用流式細胞術及TUNEL法檢測AMDV-DL124、AMDV-DL125株F7代及F45代病毒和標準弱毒株AMDV-G誘導CRFK細胞凋亡情況。流式細胞術檢測AMDV誘導CRFK細胞凋亡率結果表明,AMDV-DL124、AMDV-DL125株F7誘導CRFK細胞的凋亡率在感染后12h達最大值15.86%,明顯高于F45代和AMDV-G株誘導CRFK細胞凋亡率2.94%、1.65%,細胞凋亡主要集中在病毒感染后2~12h。TUNEL法測定結果表明病毒在感染后12h出現(xiàn)明顯凋亡;上述結果表明,AMDV-DL124和AMDV-DL125株經CRFK細胞連續(xù)傳代后誘導CRFK細胞凋亡的能力降低。本研究為后續(xù)AMDV致病性與細胞凋亡關系的研究奠定基礎。
[Abstract]:Aleutian disease of mink AMDV is one of the major diseases of mink industry in the world. The pathogen of Aleutian mink disease virus AMDV (Aleutian mink disease virusus AMDV) is chronic, persistent, progressive infection, and the quality of fur is decreased. The ability of breeding animals to reduce, also known as plasmacytosis. Because of the special mechanism of the disease, no effective vaccine has been developed to prevent and control the disease. Studies have shown that the restricted low level replication and expression of AMDV can lead to persistent infection and the formation of immune complex in minks and lead to chronic disease. Apoptosis plays an important role in the pathogenesis of AMDV. In general, continuous culture of virus in vitro is the most common method to study the pathogenicity of the virus and to obtain attenuated virus vaccine. In this experiment, the virulent strains isolated and identified in laboratory were continuously cultured in vitro, and the proliferation and apoptosis characteristics of different generations and virulence were studied. It will lay a foundation for the study of the pathogenic mechanism of AMDV and the screening of attenuated vaccine strains. The specific primers were designed, and the method of fluorescence quantitative PCR for detection of AMDV was established by optimizing the reaction conditions. The method has good specificity, sensitivity and reproducibility. To provide technical support for clinical detection of AMDV and evaluation of AMDV proliferation in CRFK cells. AMDV virulent strains AMDV-DL124 and AMDV-DL125 were cultured in CRFK cells in vitro. The proliferation characteristics of AMDV-DL124AMDV-DL125 and AMDV-DL125 in CRFK cells were studied by virus content determination, indirect immunofluorescence assay and fluorescence quantitative PCR. The results showed that the virus content of AMDV-DL124 and AMDV-DL125 strain F7 was 108.5 TCID50 / mL, which was significantly higher than that of F45 generation virus (106TCID50 / mL and AMDV-G 105.5 TCID50 / mL), but there was no significant difference between F45 generation virus and AMDV-G strain. The results of indirect immunofluorescence assay showed that AMDV-DL124 and AMDV-DL125 proliferated faster in 48h to 72h and slower in 12-24 hours, the results of fluorescence quantitative PCR showed that the nucleic acid content of AMDV in CRFK cells increased with the extension of culture time. However, the peak of AMDV-DL124AMDV-DL125 nucleic acid content was 2.4 脳 106 copies, which was significantly higher than that of F45 generation virus and AMDV-G strain, but there was no significant difference between them. The results indicated that the proliferation ability of AMDV-DL124 and AMDV-DL125 in CRFK cells was decreased after continuous culture. Flow cytometry and Tunel were used to detect the apoptosis of CRFK cells induced by AMDV-DL124AMDV-DL125 strain F7 passage, F45 generation virus and standard attenuated strain AMDV-G. The results of flow cytometry showed that the apoptosis rate of CRFK cells induced by AMDV-DL124AMDV-DL125 strain F7 reached a maximum of 15.86 at 12 h after infection, which was significantly higher than that of F45 generation and AMDV-G strain 2.941.65.The apoptosis mainly occurred in diseased cells. The results of TUNEL-mediated dUTP Nick end labeling (Tunel) at 2h after infection showed that the virus showed obvious apoptosis at 12h after infection. These results indicated that the apoptosis of CRFK cells induced by AMDV-DL124 and AMDV-DL125 decreased after continuous passage. This study laid a foundation for the further study of the relationship between the pathogenicity of AMDV and apoptosis.
【學位授予單位】：吉林農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.65

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本文編號：2013711