發(fā)布時(shí)間：2018-06-13 10:24

  本文選題：水貂阿留申病毒 + CRFK細(xì)胞��； 參考：《吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：水貂阿留申病(Aleutian disease of mink,AMD),是危害世界養(yǎng)貂業(yè)的主要疾病之一,其病原為水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus,AMDV)感染表現(xiàn)為慢性、持續(xù)性、進(jìn)行性感染,皮獸群毛皮質(zhì)量下降,種獸群繁殖能力降低,又稱為漿細(xì)胞增多癥。由于該病致病機(jī)理特殊,目前仍未研制出有效疫苗用于防控該病。研究表明,AMDV的限制性低水平復(fù)制與表達(dá),可以導(dǎo)致病貂的持續(xù)性感染和免疫復(fù)合物的形成,引發(fā)慢性疾病,而細(xì)胞凋亡在這一致病過程中發(fā)揮重要作用。通常體外連續(xù)培養(yǎng)病毒是研究病毒致病機(jī)理以及強(qiáng)毒致弱獲得弱毒疫苗侯選毒株最常規(guī)的方法。本試驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的強(qiáng)毒株進(jìn)行體外連續(xù)傳代培養(yǎng),對(duì)不同代次、不同毒力的病毒增殖特性及凋亡特性進(jìn)行研究,為AMDV致病機(jī)理研究以及弱毒疫苗侯選毒株篩選奠定基礎(chǔ)。設(shè)計(jì)特異性引物,通過反應(yīng)條件的優(yōu)化,建立了AMDV熒光定量PCR檢測方法,該方法具有較好的特異性、敏感性和重復(fù)性。為AMDV臨床檢測及AMDV在CRFK細(xì)胞的增殖評(píng)價(jià)提供技術(shù)支持。對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的AMDV強(qiáng)毒株AMDV-DL124和AMDV-DL125株第7代(F7)細(xì)胞毒在CRFK細(xì)胞中進(jìn)行體外培養(yǎng),通過培養(yǎng)條件優(yōu)化,目前已連續(xù)傳代至45代(F45)。通過病毒含量測定、間接免疫熒光試驗(yàn)和熒光定量PCR試驗(yàn)對(duì)AMDV-DL124、AMDV-DL125毒株F7代及F45代細(xì)胞毒和標(biāo)準(zhǔn)弱毒株AMDV-G株在CRFK細(xì)胞的增殖特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明,AMDV-DL124和AMDV-DL125株病毒F7代毒的病毒含量可達(dá)108.5 TCID50/mL、明顯高于F45代毒的病毒含量106 TCID50/mL和AMDV-G 105.5 TCID50/mL,而F45代毒和和AMDV-G株間,病毒含量無明顯差異;間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果表明,AMDV-DL124和AMDV-DL125株在48-72h增殖速度較快,在12-24h增殖速度較慢;熒光定量PCR試驗(yàn)結(jié)果表明,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長AMDV在CRFK細(xì)胞的核酸量不斷增加,在感染后12h后增加明顯,但AMDV-DL124、AMDV-DL125核酸量的峰值可達(dá)2.4×106個(gè)拷貝,明顯高于F45代病毒和AMDV-G株病毒,而后二者之間無明顯差異。上述結(jié)果表明,AMDV強(qiáng)毒株AMDV-DL124和AMDV-DL125經(jīng)CRFK細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)傳代后在CRFK細(xì)胞的增殖能力降低。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)及TUNEL法檢測AMDV-DL124、AMDV-DL125株F7代及F45代病毒和標(biāo)準(zhǔn)弱毒株AMDV-G誘導(dǎo)CRFK細(xì)胞凋亡情況。流式細(xì)胞術(shù)檢測AMDV誘導(dǎo)CRFK細(xì)胞凋亡率結(jié)果表明,AMDV-DL124、AMDV-DL125株F7誘導(dǎo)CRFK細(xì)胞的凋亡率在感染后12h達(dá)最大值15.86%,明顯高于F45代和AMDV-G株誘導(dǎo)CRFK細(xì)胞凋亡率2.94%、1.65%,細(xì)胞凋亡主要集中在病毒感染后2~12h。TUNEL法測定結(jié)果表明病毒在感染后12h出現(xiàn)明顯凋亡;上述結(jié)果表明,AMDV-DL124和AMDV-DL125株經(jīng)CRFK細(xì)胞連續(xù)傳代后誘導(dǎo)CRFK細(xì)胞凋亡的能力降低。本研究為后續(xù)AMDV致病性與細(xì)胞凋亡關(guān)系的研究奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Aleutian disease of mink AMDV is one of the major diseases of mink industry in the world. The pathogen of Aleutian mink disease virus AMDV (Aleutian mink disease virusus AMDV) is chronic, persistent, progressive infection, and the quality of fur is decreased. The ability of breeding animals to reduce, also known as plasmacytosis. Because of the special mechanism of the disease, no effective vaccine has been developed to prevent and control the disease. Studies have shown that the restricted low level replication and expression of AMDV can lead to persistent infection and the formation of immune complex in minks and lead to chronic disease. Apoptosis plays an important role in the pathogenesis of AMDV. In general, continuous culture of virus in vitro is the most common method to study the pathogenicity of the virus and to obtain attenuated virus vaccine. In this experiment, the virulent strains isolated and identified in laboratory were continuously cultured in vitro, and the proliferation and apoptosis characteristics of different generations and virulence were studied. It will lay a foundation for the study of the pathogenic mechanism of AMDV and the screening of attenuated vaccine strains. The specific primers were designed, and the method of fluorescence quantitative PCR for detection of AMDV was established by optimizing the reaction conditions. The method has good specificity, sensitivity and reproducibility. To provide technical support for clinical detection of AMDV and evaluation of AMDV proliferation in CRFK cells. AMDV virulent strains AMDV-DL124 and AMDV-DL125 were cultured in CRFK cells in vitro. The proliferation characteristics of AMDV-DL124AMDV-DL125 and AMDV-DL125 in CRFK cells were studied by virus content determination, indirect immunofluorescence assay and fluorescence quantitative PCR. The results showed that the virus content of AMDV-DL124 and AMDV-DL125 strain F7 was 108.5 TCID50 / mL, which was significantly higher than that of F45 generation virus (106TCID50 / mL and AMDV-G 105.5 TCID50 / mL), but there was no significant difference between F45 generation virus and AMDV-G strain. The results of indirect immunofluorescence assay showed that AMDV-DL124 and AMDV-DL125 proliferated faster in 48h to 72h and slower in 12-24 hours, the results of fluorescence quantitative PCR showed that the nucleic acid content of AMDV in CRFK cells increased with the extension of culture time. However, the peak of AMDV-DL124AMDV-DL125 nucleic acid content was 2.4 脳 106 copies, which was significantly higher than that of F45 generation virus and AMDV-G strain, but there was no significant difference between them. The results indicated that the proliferation ability of AMDV-DL124 and AMDV-DL125 in CRFK cells was decreased after continuous culture. Flow cytometry and Tunel were used to detect the apoptosis of CRFK cells induced by AMDV-DL124AMDV-DL125 strain F7 passage, F45 generation virus and standard attenuated strain AMDV-G. The results of flow cytometry showed that the apoptosis rate of CRFK cells induced by AMDV-DL124AMDV-DL125 strain F7 reached a maximum of 15.86 at 12 h after infection, which was significantly higher than that of F45 generation and AMDV-G strain 2.941.65.The apoptosis mainly occurred in diseased cells. The results of TUNEL-mediated dUTP Nick end labeling (Tunel) at 2h after infection showed that the virus showed obvious apoptosis at 12h after infection. These results indicated that the apoptosis of CRFK cells induced by AMDV-DL124 and AMDV-DL125 decreased after continuous passage. This study laid a foundation for the further study of the relationship between the pathogenicity of AMDV and apoptosis.
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：2013711