本文選題：柔嫩艾美耳球蟲 + Etgam59基因　； 參考：《揚州大學》2015年碩士論文

【摘要】：雞球蟲病是一種嚴重危害養(yǎng)雞業(yè)的原蟲病,呈世界性分布,其病原隸屬艾美耳科(Eimeriidae)艾美耳屬(Eimeria),世界公認的有7種,其中雞柔嫩艾美耳球蟲(E. tenella)流行最廣泛,致病性最強,危害最大。長期起來,雞球蟲病的防治主要依靠藥物。但是隨著球蟲對藥物普遍產(chǎn)生了耐藥性,使藥效不斷降低。此外,藥物在飼料中長期添加可殘留肉蛋,危害人體健康,同時也污染環(huán)境。因此,雞球蟲病的疫苗免疫預防越來越受到重視,并被養(yǎng)殖企業(yè)所接受。目前,臨床上應用的雞球蟲病疫苗有兩大類,一類是由數(shù)種雞球蟲卵囊組成的活疫苗,另一類是由3種天然的配子體蛋白組成的亞單位疫苗。雖然活疫苗的免疫效果較好,但存在諸多問題,如病原容易擴散、致弱蟲株毒力易返強、蟲株的抗原變異、疫苗導致飼料報酬降低、疫苗接種的劑量難以控制、免疫后的監(jiān)測和管理技術要求高等。天然蛋白組成的亞單位疫苗能克服上述缺點,但這類疫苗需從感染雞體分離純化配子體,然后再用親和柱層析的方法分離純化配子體蛋白,因此生產(chǎn)費時、成本昂貴。利用基因重組技術研制基因工程疫苗可能解決這一難題。柔嫩艾美耳球蟲配子體蛋白EtGAM59是配子體發(fā)育階段特異性表達的一種蛋白,參與卵囊壁的形成。迄今,在國內尚無有該基因的序列報道,其原核表達及其表達產(chǎn)物的免疫保護力等在國內外也未見有報道。為此,本研究在對柔嫩艾美耳球蟲配子體Etgam59基因進行克隆和序列分析的基礎上,構建了該基因的原核表達質粒并進行誘導表達,對表達產(chǎn)物的免疫原性和免疫保護力進行了評價,并對該基因表達產(chǎn)物在蟲體內的定位和功能進行了探究,旨在為雞球蟲病基因工程疫苗的研制奠定基礎。1柔嫩艾美耳球蟲Etgam59基因的克隆與序列分析分離純化E. tenella揚州株的配子體,提取總RNA后用RT-PCR方法擴增出Etgam59基因。將目的片段與pGEM-T-Easy載體連接,常規(guī)方法轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,藍白斑法篩選陽性克隆,經(jīng)PCR和EcoR Ⅰ酶切鑒定后測序,用相關軟件進行序列分析。結果顯示,克隆的Etgam59基因全長為1617 bp,與E. tenella基因組序列中Etgam59進行比較,兩者的同源性為99.9%；該基因編碼538個氨基酸,經(jīng)預測軟件分析該蛋白存在一個酪氨酸-絲氨酸和脯氨酸-甲硫氨酸富集區(qū),擁有13個抗原決定簇,在酪氨酸一絲氨酸和脯氨酸-甲硫氨酸富集區(qū)內含有3個抗原表位。2柔嫩艾美耳球蟲Etgam59基因的原核表達與免疫原性分析根據(jù)目的基因在去掉信號肽序列后以及表達載體pET-28a(+)的序列特點設計特異性引物,以構建的重組質粒pGEM-T-Easy-Etgam59為模板,經(jīng)PCR擴增出大小為1569 bp的目的片段,并將其插入到載體pET-28a(+)上,構建成重組表達載體pET-28a(+)-Etgam59,將其轉化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3),經(jīng)誘導后表達出分子量為61.2 kDa的可溶性蛋白(rEtGAM59);經(jīng)Western-blot檢測,rEtGAM59蛋白能被抗6×HIS標簽單抗和鼠抗rEtGAM59蛋白多抗所識別,也能被E. maxima、柔嫩艾美耳球蟲(E. tenella)和毒害艾美耳球蟲(E. necatrix)的康復血清所識別,顯示rEtGAM59蛋白具有抗原性。3柔嫩艾美耳球蟲Etgam59基因的定位分析7周齡雛雞逐只經(jīng)口感染1×108個E. tenella揚州株孢子化卵囊。感染后96 h、108h、 120 h、132 h、144 h、156 h、168 h分別撲殺雛雞,取盲腸組織制作石蠟組織切片,分別進行H.E.染色和免疫熒光組織化學染色。結果顯示,熒光標記僅出現(xiàn)在大配子體的成壁體和卵囊壁,表明Etgam59基因在配子體節(jié)段特異性表達,其表達產(chǎn)物主要位于大配子體的成壁體上,并參與卵囊壁的形成。4重組蛋白rEtGAM59對雞球蟲病的免疫保護力以雛雞為試驗動物,設計了2個試驗,以死亡率、相對增重率、盲腸病變值、卵囊產(chǎn)量與卵囊減少率、體液抗體水平等為指標,評價了重組蛋白rEtGAM59的免疫保護效果。結果顯示：三個重組蛋白+佐劑免疫組的免疫保護力均低于卵囊免疫組(P0.05),但好于其他各免疫組(P0.05),其中以重組蛋白+佐劑中劑量組免疫效果最好；佐劑免疫組在增重、卵囊減少率等方面相同于重組蛋白免疫組,均接近未免疫攻蟲組(P0.05)。
[Abstract]:In this paper , it has been reported that the vaccine has two main types , such as easy diffusion of pathogenic bacteria , low dose of vaccine , and high requirement for immune protection . In addition , the vaccine has two main types , such as easy diffusion of pathogenic bacteria , low dose of vaccine inoculation , and high requirement for immune protection . The results showed that the total length of the cloned Etgam59 gene was 1617 bp , compared with Etgam59 in E . tenella genome sequence , and the homology was 99.9 % .
The recombinant plasmid pET - 28a ( + ) - Etgam59 was transformed into competent E . coli BL21 ( DE3 ) . The recombinant plasmid pET - 28a ( + ) - Etgam59 was transformed into competent E . coli BL21 ( DE3 ) . The results showed that the immune protective effects of the three recombinant protein + adjuvant immune groups were lower than those in the immunized group ( P0.05 ) , but better than other immune groups ( P0.05 ) . The results showed that the immune protective effect of the recombinant protein rEtchant 59 was the best in the dose group of the recombinant protein + adjuvant .
The immune group of adjuvant was similar to the recombinant protein immune group in the aspects of weight gain , egg sac reduction rate and so on , which were close to the unvaccinated group ( P0.05 ) .
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S858.31

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本文編號：2007561