發(fā)布時(shí)間：2018-06-12 01:13

  本文選題：柔嫩艾美耳球蟲(chóng) + Etgam59基因　； 參考：《揚(yáng)州大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：雞球蟲(chóng)病是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的原蟲(chóng)病,呈世界性分布,其病原隸屬艾美耳科(Eimeriidae)艾美耳屬(Eimeria),世界公認(rèn)的有7種,其中雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(E. tenella)流行最廣泛,致病性最強(qiáng),危害最大。長(zhǎng)期起來(lái),雞球蟲(chóng)病的防治主要依靠藥物。但是隨著球蟲(chóng)對(duì)藥物普遍產(chǎn)生了耐藥性,使藥效不斷降低。此外,藥物在飼料中長(zhǎng)期添加可殘留肉蛋,危害人體健康,同時(shí)也污染環(huán)境。因此,雞球蟲(chóng)病的疫苗免疫預(yù)防越來(lái)越受到重視,并被養(yǎng)殖企業(yè)所接受。目前,臨床上應(yīng)用的雞球蟲(chóng)病疫苗有兩大類(lèi),一類(lèi)是由數(shù)種雞球蟲(chóng)卵囊組成的活疫苗,另一類(lèi)是由3種天然的配子體蛋白組成的亞單位疫苗。雖然活疫苗的免疫效果較好,但存在諸多問(wèn)題,如病原容易擴(kuò)散、致弱蟲(chóng)株毒力易返強(qiáng)、蟲(chóng)株的抗原變異、疫苗導(dǎo)致飼料報(bào)酬降低、疫苗接種的劑量難以控制、免疫后的監(jiān)測(cè)和管理技術(shù)要求高等。天然蛋白組成的亞單位疫苗能克服上述缺點(diǎn),但這類(lèi)疫苗需從感染雞體分離純化配子體,然后再用親和柱層析的方法分離純化配子體蛋白,因此生產(chǎn)費(fèi)時(shí)、成本昂貴。利用基因重組技術(shù)研制基因工程疫苗可能解決這一難題。柔嫩艾美耳球蟲(chóng)配子體蛋白EtGAM59是配子體發(fā)育階段特異性表達(dá)的一種蛋白,參與卵囊壁的形成。迄今,在國(guó)內(nèi)尚無(wú)有該基因的序列報(bào)道,其原核表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的免疫保護(hù)力等在國(guó)內(nèi)外也未見(jiàn)有報(bào)道。為此,本研究在對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)配子體Etgam59基因進(jìn)行克隆和序列分析的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性和免疫保護(hù)力進(jìn)行了評(píng)價(jià),并對(duì)該基因表達(dá)產(chǎn)物在蟲(chóng)體內(nèi)的定位和功能進(jìn)行了探究,旨在為雞球蟲(chóng)病基因工程疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。1柔嫩艾美耳球蟲(chóng)Etgam59基因的克隆與序列分析分離純化E. tenella揚(yáng)州株的配子體,提取總RNA后用RT-PCR方法擴(kuò)增出Etgam59基因。將目的片段與pGEM-T-Easy載體連接,常規(guī)方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,藍(lán)白斑法篩選陽(yáng)性克隆,經(jīng)PCR和EcoR Ⅰ酶切鑒定后測(cè)序,用相關(guān)軟件進(jìn)行序列分析。結(jié)果顯示,克隆的Etgam59基因全長(zhǎng)為1617 bp,與E. tenella基因組序列中Etgam59進(jìn)行比較,兩者的同源性為99.9%；該基因編碼538個(gè)氨基酸,經(jīng)預(yù)測(cè)軟件分析該蛋白存在一個(gè)酪氨酸-絲氨酸和脯氨酸-甲硫氨酸富集區(qū),擁有13個(gè)抗原決定簇,在酪氨酸一絲氨酸和脯氨酸-甲硫氨酸富集區(qū)內(nèi)含有3個(gè)抗原表位。2柔嫩艾美耳球蟲(chóng)Etgam59基因的原核表達(dá)與免疫原性分析根據(jù)目的基因在去掉信號(hào)肽序列后以及表達(dá)載體pET-28a(+)的序列特點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物,以構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEM-T-Easy-Etgam59為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增出大小為1569 bp的目的片段,并將其插入到載體pET-28a(+)上,構(gòu)建成重組表達(dá)載體pET-28a(+)-Etgam59,將其轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3),經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)出分子量為61.2 kDa的可溶性蛋白(rEtGAM59);經(jīng)Western-blot檢測(cè),rEtGAM59蛋白能被抗6×HIS標(biāo)簽單抗和鼠抗rEtGAM59蛋白多抗所識(shí)別,也能被E. maxima、柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(E. tenella)和毒害艾美耳球蟲(chóng)(E. necatrix)的康復(fù)血清所識(shí)別,顯示rEtGAM59蛋白具有抗原性。3柔嫩艾美耳球蟲(chóng)Etgam59基因的定位分析7周齡雛雞逐只經(jīng)口感染1×108個(gè)E. tenella揚(yáng)州株孢子化卵囊。感染后96 h、108h、 120 h、132 h、144 h、156 h、168 h分別撲殺雛雞,取盲腸組織制作石蠟組織切片,分別進(jìn)行H.E.染色和免疫熒光組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示,熒光標(biāo)記僅出現(xiàn)在大配子體的成壁體和卵囊壁,表明Etgam59基因在配子體節(jié)段特異性表達(dá),其表達(dá)產(chǎn)物主要位于大配子體的成壁體上,并參與卵囊壁的形成。4重組蛋白rEtGAM59對(duì)雞球蟲(chóng)病的免疫保護(hù)力以雛雞為試驗(yàn)動(dòng)物,設(shè)計(jì)了2個(gè)試驗(yàn),以死亡率、相對(duì)增重率、盲腸病變值、卵囊產(chǎn)量與卵囊減少率、體液抗體水平等為指標(biāo),評(píng)價(jià)了重組蛋白rEtGAM59的免疫保護(hù)效果。結(jié)果顯示：三個(gè)重組蛋白+佐劑免疫組的免疫保護(hù)力均低于卵囊免疫組(P0.05),但好于其他各免疫組(P0.05),其中以重組蛋白+佐劑中劑量組免疫效果最好；佐劑免疫組在增重、卵囊減少率等方面相同于重組蛋白免疫組,均接近未免疫攻蟲(chóng)組(P0.05)。
[Abstract]:In this paper , it has been reported that the vaccine has two main types , such as easy diffusion of pathogenic bacteria , low dose of vaccine , and high requirement for immune protection . In addition , the vaccine has two main types , such as easy diffusion of pathogenic bacteria , low dose of vaccine inoculation , and high requirement for immune protection . The results showed that the total length of the cloned Etgam59 gene was 1617 bp , compared with Etgam59 in E . tenella genome sequence , and the homology was 99.9 % .
The recombinant plasmid pET - 28a ( + ) - Etgam59 was transformed into competent E . coli BL21 ( DE3 ) . The recombinant plasmid pET - 28a ( + ) - Etgam59 was transformed into competent E . coli BL21 ( DE3 ) . The results showed that the immune protective effects of the three recombinant protein + adjuvant immune groups were lower than those in the immunized group ( P0.05 ) , but better than other immune groups ( P0.05 ) . The results showed that the immune protective effect of the recombinant protein rEtchant 59 was the best in the dose group of the recombinant protein + adjuvant .
The immune group of adjuvant was similar to the recombinant protein immune group in the aspects of weight gain , egg sac reduction rate and so on , which were close to the unvaccinated group ( P0.05 ) .
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S858.31

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本文編號(hào)：2007561