發(fā)布時(shí)間：2018-06-08 22:42

  本文選題：ATRA + 軟骨細(xì)胞　； 參考：《吉林大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：軟骨細(xì)胞分化對(duì)于軟骨內(nèi)成骨是必要的,軟骨內(nèi)成骨通常發(fā)生在肢芽和生長板的形態(tài)發(fā)生中及在骨損傷的再生和修復(fù)中。前人研究證明,鹿茸是唯一的失去后還可完全再生的哺乳動(dòng)物附屬器官,其生長也包括軟骨內(nèi)成骨過程。鹿茸的再生涉及到包括軟骨在內(nèi)的多種組織的共同發(fā)育。因此,鹿茸可為研究軟骨發(fā)育、軟骨內(nèi)成骨及組織的快速生長提供了一個(gè)理想模型。ATRA注射能顯著刺激初角茸的生長,但其調(diào)控機(jī)制還不清楚。有報(bào)道指出ATRA在調(diào)控軟骨細(xì)胞增殖與分化過程中發(fā)揮重要的作用,因此,我們推測ATRA可能通過促進(jìn)鹿茸軟骨細(xì)胞的增殖與分化刺激鹿茸的生長。在本研究中我們通過原位雜交、流式細(xì)胞術(shù)、MTS分析、熒光定量PCR、基因過表達(dá)和RNA干擾等方法研究了ATRA對(duì)鹿茸軟骨細(xì)胞增殖與分化的作用,并探討了它的調(diào)控機(jī)理。研究結(jié)果表明ATRA可促進(jìn)鹿茸軟骨細(xì)胞的增殖和CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CDK2、CDK4和CDK6的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期結(jié)果表明,ATRA處理軟骨細(xì)胞能促進(jìn)細(xì)胞由G1期向S期過渡,進(jìn)一步揭示了ATRA促進(jìn)鹿茸軟細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制。ATRA能刺激軟骨細(xì)胞分化標(biāo)志分子COL X和MMP13的表達(dá)。原位雜交結(jié)果表明RA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CRABP2 m RNA在鹿茸軟骨細(xì)胞中有表達(dá)。CRABP2基因沉默可減弱ATRA對(duì)軟骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用,而CRABP2過表達(dá)則表現(xiàn)出相反的作用。ATRA代謝酶CYP26A1和CYP26B1也在鹿茸軟骨細(xì)胞中高表達(dá)。特異性si RNA或聯(lián)合拮抗劑R115866介導(dǎo)的CYP26A1或/和CYP26B1的抑制可增強(qiáng)ATRA對(duì)軟骨細(xì)胞分化的促進(jìn)效應(yīng),而過表達(dá)CYP26B1可削弱鹿茸軟骨細(xì)胞對(duì)ATRA的敏感性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),RA受體RARα、RARβ、RARγ、RXRα和RXRβ均在鹿茸軟骨中有表達(dá)。RARα激動(dòng)劑Am80處理軟骨細(xì)胞可誘導(dǎo)COL X和MMP13的表達(dá)。相反,RARα拮抗劑Ro 41-5253或RXRαsi RNA處理可抑制ATRA對(duì)軟骨細(xì)胞分化的刺激效應(yīng)。進(jìn)一步研究證實(shí),ATRA可通過活化RARα/RXRα受體異二聚體抑制BMP2和WNT4的表達(dá)。BMP2和WNT4 m RNA在鹿茸軟骨細(xì)胞中也有表達(dá)。BMP2和WNT4的敲低可分別增強(qiáng)ATRA對(duì)COL X和MMP13表達(dá)的誘導(dǎo)效應(yīng),而BMP2或WNT4的過表達(dá)抑制了ATRA的促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化的作用。WNT4 si RNA轉(zhuǎn)染可反轉(zhuǎn)BMP2過表達(dá)對(duì)軟骨細(xì)胞分化的抑制效應(yīng)。同時(shí),WNT4過表達(dá)則可阻礙BMP2 si RNA引起的COL X和MMP13表達(dá)的上調(diào)。通過轉(zhuǎn)染BMP2 si RNA或過表達(dá)質(zhì)粒后再添加ATRA,檢測鹿茸軟骨細(xì)胞WNT4的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,BMP2可介導(dǎo)ATRA對(duì)WNT4表達(dá)的調(diào)控。特異性si RNA介導(dǎo)的RUNX1表達(dá)的下調(diào)可顯著抑制ATRA對(duì)鹿茸軟骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)效應(yīng)。相反,外源性r RUNX1的處理可顯著刺激ATRA對(duì)軟骨細(xì)胞COL X和MMP13表達(dá)的促進(jìn)作用。與此同時(shí),RUNX1也可介導(dǎo)BMP2和WNT4對(duì)鹿茸軟骨細(xì)胞分化的調(diào)控。此外,WNT4 si RNA的轉(zhuǎn)染可抑制BMP2過表達(dá)引起的軟骨細(xì)胞RUNX1表達(dá)的下調(diào),同時(shí)WNT4過表達(dá)則可反轉(zhuǎn)BMP2 si RNA對(duì)RUNX1表達(dá)的促進(jìn)作用。BMP2或WNT4在鹿茸軟骨細(xì)胞中的敲低可增強(qiáng)ATRA對(duì)RUNX1表達(dá)的誘導(dǎo)作用,而BMP2或WNT4的過表達(dá)能反轉(zhuǎn)ATRA的促進(jìn)作用。綜上所述,ATRA可活化RARα和RXRα受體進(jìn)而通過BMP2-WNT4-RUNX1通路誘導(dǎo)鹿茸軟骨細(xì)胞的分化。CRABP2可增強(qiáng)ATRA對(duì)軟骨細(xì)胞BMP2、WNT4和RUNX1的表達(dá)及軟骨細(xì)胞分化的調(diào)控作用,而CYP26A1和CYP26B1則可減弱鹿茸軟骨細(xì)胞對(duì)ATRA的敏感性。
[Abstract]:The results showed that ATRA could stimulate the proliferation and differentiation of cartilage cells . The results showed that ATRA could stimulate the proliferation and differentiation of cartilage cells . In conclusion , ATRA can activate RAR偽and RXR alpha receptors to enhance the expression of RUNX1 , while the overexpression of BMP2 or WNT4 can enhance the expression of RUNX1 , while the overexpression of BMP2 or WNT4 can enhance the differentiation of cartilage cells .
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S825

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本文編號(hào)：1997496