本文選題：巴斯德畢赤酵母 + 巨型艾美耳球蟲��； 參考：《揚(yáng)州大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：雞球蟲病是由多種艾美耳球蟲(Eimeria)寄生于雞腸道黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)所引起的一種寄生原蟲病,不僅引起雞發(fā)病死亡,還可嚴(yán)重影響雞的生長發(fā)育,降低飼料報(bào)酬。目前雞球蟲病的防治主要依靠化學(xué)藥物,其次是雞球蟲病活疫苗。隨著抗球蟲藥物的廣泛與大量使用,球蟲耐藥性以及人們對(duì)藥物殘留肉蛋、污染環(huán)境等諸多問題也隨之出現(xiàn)。同時(shí)活球蟲疫苗又存在生產(chǎn)成本高、容易擴(kuò)散病原、容易引起腸炎發(fā)生等弊端。為此,亞單位疫苗已成為雞球蟲病疫苗的發(fā)展方向。CoxAbic(?)是由巨型艾美耳球蟲(E. maxima)配子體蛋白EmGam56、EmGam82和EmGam230組成的一種亞單位疫苗,在其生產(chǎn)過程中需從感染雞體分離純化配子體,然后再用親和柱層析的方法分離純化配子體蛋白,因此生產(chǎn)費(fèi)時(shí)、成本昂貴。利用基因重組技術(shù)研制基因工程疫苗可能解決這一難題。巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是一種真核表達(dá)系統(tǒng),不僅具有操作簡單、生長速度快、發(fā)酵成本低廉等優(yōu)點(diǎn),還具有高等真核表達(dá)系統(tǒng)的蛋白翻譯后的加工修飾功能,該系統(tǒng)所表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué)活性和生物學(xué)功能與天然蛋白質(zhì)更為接近。因此,本研究在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)了E. maxima配子體蛋白Emgam56基因,檢測了酵母表達(dá)蛋白rEmGam56的抗原特異性和免疫原性,并通過動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)比較分析了酵母表達(dá)蛋白rEmGam56和原核表達(dá)蛋白rEmGam56對(duì)E. maxima的免疫保護(hù)效果,為重組配子體抗原亞單位疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。1.巨型艾美耳球蟲Emgam56基因的畢赤酵母表達(dá)及其初步鑒定根據(jù)Emgam56基因去除信號(hào)肽后的ORF序列和真核表達(dá)載體pPICzaA的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物,以本實(shí)驗(yàn)室保存的重組質(zhì)粒pGEM-T-Emgam56為模板,PCR擴(kuò)增出目的片段,插入表達(dá)載體pPICzαA中,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPICzaA對(duì)酶切鑒定和PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序,將連接正確的重組質(zhì)粒線性化后用電穿孔法轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115,利用博萊霉素(Zeocin)抗性篩選多拷貝重組菌株,搖瓶水平進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),所得蛋白大小約為11.6 kDa,且能被6×HIS單抗識(shí)別。2.巨型艾美耳球蟲畢赤酵母重組表達(dá)蛋白rEmGam56的免疫原性分析分別以鼠抗酵母表達(dá)蛋白rEmGam56多克隆抗體、鼠抗原核表達(dá)蛋白rEmGam56多克隆抗體和E. maxima雞康復(fù)血清為一抗,對(duì)酵母表達(dá)蛋白rEmGam56進(jìn)行Western-blot檢測,結(jié)果顯示該蛋白具有良好的免疫原性。以酵母表達(dá)蛋白rEmGam56為抗原,用間接ELISA方法檢測鼠抗酵母表達(dá)蛋白rEmGam56多抗、原核表達(dá)蛋白rEmGam56多抗和雞康復(fù)血清,顯示該重組蛋白能刺激機(jī)體產(chǎn)生一定的抗體水平,并且能識(shí)別雞康復(fù)血清中的特異性抗體。3.巨型艾美耳球蟲畢節(jié)酵母重組表達(dá)蛋白rEmGam56的免疫保護(hù)效果以雛雞為試驗(yàn)動(dòng)物,以死亡率、相對(duì)增重率、病變記分減少率與相對(duì)卵囊產(chǎn)量、細(xì)胞免疫和體液免疫水平等為評(píng)價(jià)指標(biāo),對(duì)酵母表達(dá)蛋白rEmGam56的免疫保護(hù)效果進(jìn)行了初步研究,并與原核表達(dá)蛋白rEmGam56和卵囊的免疫效果相比較。結(jié)果顯示：酵母表達(dá)蛋白高劑量組(60μg/羽雞)和原核表達(dá)蛋白高劑量組(300 μg/羽雞)的免疫效果最佳,但都低于卵囊免疫組；其中酵母表達(dá)蛋白高劑量組(60μg/羽雞)的免疫效果略低于原核表達(dá)蛋白高劑量組(300μg/羽雞)。
[Abstract]:The present study is a kind of eukaryotic expression system , which has the advantages of simple operation , high growth speed , low fermentation cost and so on . It has the advantages of simple operation , high growth speed , low fermentation cost and so on . The results showed that the recombinant protein could stimulate the organism to produce a certain antibody level . The results showed that the recombinant protein could stimulate the organism to produce certain antibody level . The results showed that the recombinant protein could stimulate the organism to produce certain antibody level . The results showed that the immune effect of the high dose group ( 60 渭g / feather chicken ) and the high dose group ( 300 渭g / feather chicken ) in the prokaryotic expression protein were the best , but it was lower than that of the immune group of the egg sac .
The immune effect of high - dose group ( 60 渭g / feather ) in yeast expression protein was slightly lower than that of prokaryotic expression protein high - dose group ( 300 渭g / feather chicken ) .
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.7

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本文編號(hào)：1944045