本文選題：豬 + IFITM3基因��； 參考：《河南農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：干擾素是一種具有抗病毒、抑制細(xì)胞分裂、調(diào)節(jié)免疫和促進(jìn)細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子,干擾素通過與其受體結(jié)合,誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)干擾素刺激基因(Interferon Stimulated Genes,ISGs)產(chǎn)生,表達(dá)相應(yīng)的蛋白質(zhì)從而完成多種生物學(xué)功能。干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白3(Interferon-induced transmembrane protein 3,IFITM3)基因是一種重要的干擾素刺激基因。IFITM3具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化、細(xì)胞增殖和抵御病毒入侵等多種生物學(xué)功能。目前對(duì)于IFITM3基因的研究主要集中在人和鼠方面,著重于IFITM3基因在腫瘤組織和癌細(xì)胞中表達(dá)豐度的變化。有關(guān)豬IFITM3基因的研究集中在其抗病毒作用方面,具體機(jī)制尚不清楚。PiggyBac(PB)轉(zhuǎn)座子能快速高效地將目的基因插入真核細(xì)胞基因組中,為在細(xì)胞中評(píng)價(jià)目的基因的功能提供了便利。本文旨在構(gòu)建豬IFITM3基因的PB轉(zhuǎn)座子重組載體,并初步在PK15細(xì)胞中對(duì)其表達(dá)進(jìn)行評(píng)價(jià),為進(jìn)一步研究該基因在細(xì)胞水平的抗病毒機(jī)制奠定前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。利用RT-PCR方法從豬脾臟組織中對(duì)IFITM3基因ORF區(qū)進(jìn)行克隆,分析IFITM3基因在豬各組織中的表達(dá),以p ET-21b(+)為骨架構(gòu)建原核重組表達(dá)載體,利用SDS-PAGE和Western Blot分析IFITM3基因在大腸桿菌中的融合表達(dá),用PB轉(zhuǎn)座子構(gòu)建真核重組表達(dá)載體PB-IFITM3,將IFITM3基因轉(zhuǎn)染整合到PK15細(xì)胞基因組中,QRT-PCR方法檢測(cè)IFITM3等基因在PK15細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平,評(píng)價(jià)IFITM3基因過表達(dá)對(duì)LPS介導(dǎo)的炎性信號(hào)分子表達(dá)的影響。結(jié)果顯示:克隆的豬IFITM3基因長(zhǎng)度為438 bp,編碼145個(gè)氨基酸;IFITM3基因在豬脾臟和肺臟中表達(dá)豐度較高;原核表達(dá)載體所表達(dá)的蛋白大小為22.3ku,其中一部分為可溶性蛋白,另一部分以包涵體形式存在;構(gòu)建了PB-IFITM3真核重組表達(dá)載體,實(shí)現(xiàn)了IFITM3基因在PK15細(xì)胞中的過表達(dá);QRT-PCR結(jié)果顯示:IFITM3基因過表達(dá)后用LPS處理,能進(jìn)一步上調(diào)IFITM3基因表達(dá),且依賴于作用時(shí)間;TLR4、NFκB、IFN-α、IFN-β和TNF-α基因表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05),與LPS作用呈現(xiàn)時(shí)間依賴性;TBK1、p38 MAPK的基因表達(dá)水平略有下調(diào),但在4h和8h時(shí)不明顯,12h下調(diào)明顯。提示IFITM3基因過表達(dá)能在一定程度上抑制LPS激活的TLR4信號(hào)通路。
[Abstract]:Interferon is a kind of cytokine with many biological activities, such as anti-virus, inhibiting cell division, regulating immunity and promoting cell apoptosis. Interferon induces the production of Interferon Stimulated genes by binding to its receptor. Expression of the corresponding protein to complete a variety of biological functions. IFITM3 is an important interferon stimulating gene. IFITM3 has many biological functions, such as regulating cell growth and differentiation, cell proliferation and resisting virus invasion. At present, the study of IFITM3 gene is mainly focused on human and mouse, focusing on the changes of the expression abundance of IFITM3 gene in tumor tissues and cancer cells. The research on porcine IFITM3 gene is focused on its antiviral effect. The specific mechanism is not clear. The transposon can rapidly and efficiently insert the target gene into the eukaryotic cell genome, which provides convenience for evaluating the function of the target gene in the cell. The aim of this study was to construct the recombinant vector of porcine IFITM3 gene, and to evaluate its expression in PK15 cells, so as to lay a foundation for further study on the antiviral mechanism of porcine IFITM3 gene at cell level. The ORF region of IFITM3 gene was cloned from porcine spleen tissue by RT-PCR method, and the expression of IFITM3 gene in pig tissues was analyzed. The prokaryotic expression vector was constructed with pET-21b () as the skeleton. The fusion expression of IFITM3 gene in Escherichia coli was analyzed by SDS-PAGE and Western Blot. The eukaryotic expression vector PB-IFITM3 was constructed by PB transposon. The IFITM3 gene was transfected into PK15 cell genome to detect the mRNA expression level of IFITM3 and other genes in PK15 cells. To evaluate the effect of overexpression of IFITM3 gene on the expression of inflammatory signaling molecules mediated by LPS. The results showed that the length of the cloned porcine IFITM3 gene was 438bp, encoding 145 amino acids, IFITM3 gene was highly expressed in the spleen and lung of pigs, and the protein expressed by the prokaryotic expression vector was 22.3ku. some of which were soluble proteins. In the other part, the eukaryotic expression vector of PB-IFITM3 was constructed, and the overexpression of IFITM3 gene in PK15 cells was realized by QRT-PCR. The results showed that the expression of IFITM3 gene could be upregulated further after the overexpression of IFITM3 gene was treated with LPS. The expression of IFN- 尾 and TNF- 偽 down-regulated the expression of TLR4N- 偽 -IFN- 尾 and TNF- 偽 in a time-dependent manner, and the expression level of TBK1p38 MAPK was down-regulated in a time-dependent manner with LPS, but it was not significantly down-regulated at 4h and 8h. These results suggest that overexpression of IFITM3 gene can inhibit the TLR4 signaling pathway activated by LPS to some extent.
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S828

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本文編號(hào)：1933865