本文選題：哺乳動物DNA + 內(nèi)源性內(nèi)部控制系統(tǒng)�。� 參考：《揚州大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)作為一種特異靈敏的分子診斷工具,被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域。然而從樣品采集、運輸、保存、核酸提取到PCR檢測的整個過程中都可能存在一些因素,影響被檢核酸的質(zhì)量和水平,造成檢測結(jié)果的假陽性或假陰性。為提高PCR檢測結(jié)果的可信度,非常有必要建立一種內(nèi)源性內(nèi)部控制(endogenous internal control, EIC)系統(tǒng),實現(xiàn)從樣品采集到PCR檢測的全程質(zhì)量監(jiān)控。在本論文的研究一,我們設(shè)計了一套針對哺乳動物羥甲基膽色烷合成酶(hydroxymethylbilane synthase, HMB S)基因的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET).定量PCR (quantitative PCR, qPCR)的EIC系統(tǒng)。在研究二及研究三,應(yīng)用建立的EIC作為質(zhì)量控制系統(tǒng),保證分子檢測結(jié)果的準確度和可信性,從而開展對哥斯達黎加和尼加拉瓜的七種蟲媒疾病的分子流行病學(xué)調(diào)查。本研究建立的EIC系統(tǒng)可擴增人和12種哺乳動物(犬、貓、牛、小鼠、豬、驢、馬、猴子、綿羊、山羊、獅子、獵豹)、小鼠的11種組織或臟器(心、肝、腦、脾、肺、脂肪、腎、肌肉、毛發(fā)、骨、皮膚)的DNA。此方法也可方便地用于蚊子的吸血體積及對應(yīng)血液的宿主來源的判定。蚊子樣本PCR擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果發(fā)現(xiàn),本研究采集的蚊子吸取了6種哺乳動物的血液。本系統(tǒng)的靈敏度高(0.05 ng組織或0.5 nl血液/反應(yīng)體系)特異性好,并可區(qū)別不同的哺乳動物物種,因此可成為哺乳動物核酸PCR檢測的理想EIC系統(tǒng),同時也是研究吸血節(jié)肢動物的有用工具。蟲媒疾病為熱帶地區(qū)犬發(fā)病和死亡的重要原因,但是關(guān)于這類疾病在中美洲地區(qū)的流行信息卻十分有限。本研究應(yīng)用了FRET-qPCR檢測犬的全血核酸樣本,調(diào)查七種蟲媒疾病在尼加拉瓜和哥斯達黎加犬中的流行情況。在尼加拉瓜,犬全血核酸樣本(n=39)攜帶有5種病原體：貓立克次體(陽性率5%)、巴貝斯蟲(26%)、犬肝簇蟲(51%)、扁平無漿體(13%)、犬埃立克次體(56%),而貝納柯克斯體及犬心絲蟲的檢測結(jié)果為陰性。其中共有30只犬(80%)檢測結(jié)果為陽性,12只(31%)攜帶一種病原體,11只(28%)攜帶兩種病原體,3只(8%)攜帶三種病原體,4只(10%)攜帶四種病原體。在哥斯達黎加,犬全血核酸樣本(n=40)中沒有檢測到貓立克次體及貝納柯克斯體的核酸,但另外5種蟲媒疾病病原體的檢測結(jié)果分別為：犬心絲蟲(陽性率22.5%)、犬肝簇蟲(37.5%)、巴貝斯蟲(25%)、扁平無漿體(7.5%)、犬埃立克次體(50%)。9只犬(22.5%)的全血核酸中沒有檢測到蟲媒疾病病原體,14只(35%)感染有一種病原體,11只(27.5%)感染有兩種病原體,4只(10%)感染有三種病原體,1只(2.5%)感染有五種病原體。本研究成功地建立了一套基于HMBS基因FRET-qPCR的EIC系統(tǒng),該系統(tǒng)靈敏度高、特異性強,可實現(xiàn)PCR檢測過程的全程監(jiān)控,并適用于所有哺乳動物DNA樣本。進行犬蟲媒疾病分子流行病學(xué)調(diào)查時,本研究首次報道了在中美洲地區(qū)吉氏巴貝斯蟲的存在。調(diào)查結(jié)果也表明犬蟲媒疾病在尼加拉瓜、哥斯達黎加的犬中的流行十分普遍,且有些疾病可以感染人類。
[Abstract]:Polymerase chain reaction (PCR), as a specific and sensitive molecular diagnostic tool, is widely used in all fields of life science research. However, the whole process of sample collection, transportation, preservation, nucleic acid extraction and PCR detection may be stored in some factors, affecting the quality and level of the detected nucleic acid. In order to improve the reliability of the results of PCR detection, it is very necessary to establish an endogenous internal control (endogenous internal control, EIC) system to realize the whole process quality monitoring from sample collection to PCR detection. In this paper, we designed a set of mammal hydroxymethyl bile. The fluorescence resonance energy transfer (fluorescence resonance energy transfer, FRET) of the hydroxymethylbilane synthase (HMB S) gene. In study two and study three, the application established as a quality control system to ensure the accuracy and credibility of molecular detection results, A molecular epidemiological survey of seven insect borne diseases in Costa Rica and Nicaragua was conducted. The EIC system established in this study could amplify human and 12 mammals (dogs, cats, cattle, mice, pigs, donkeys, horses, monkeys, sheep, goats, lions, cheetahs), and 11 tissues or organs of mice (heart, liver, brain, spleen, lung, fat, kidney, muscle, hair, bone, The DNA. method of skin can also be conveniently used for the bloodsucking volume of mosquitoes and the determination of the source of the host of the blood. The sequencing of the PCR amplification products of the mosquito sample found that the mosquitoes collected in this study have suck up the blood of 6 mammals. The sensitivity of the system is high (0.05 ng or 0.5 NL blood / reaction system), and the specificity is good and can be used. Different mammal species can be used as an ideal EIC system for the detection of mammalian nucleic acid PCR, and it is also a useful tool for studying blood sucking arthropods. Insect vector disease is an important cause of the disease and death of dogs in the tropics, but the epidemic information about this kind of disease in the Central American region is very limited. FRET-qPCR tested the whole blood nucleic acid samples of the dog and investigated the prevalence of seven insect borne diseases in Nicaragua and Costa Rica. In Nicaragua, the dog whole blood nucleic acid samples (n=39) carried 5 pathogens: Rickettsia cat (positive rate 5%), Babes (26%), canine liver tutua (51%), flat no pulp (13%), and dog Erik subbody (56%). There were 30 dogs (80%) tested positive, 12 (31%) carrying one pathogen, 11 (28%) carrying two pathogens, 3 (8%) carrying three pathogens and 4 (10%) carrying four kinds of Mycoplasma. In Costa Rica, n=40 (n=40) was not detected in Costa Rica, and the dog whole blood nucleic acid sample (n=40) was not detected. The nucleic acid of Rickettsia cat and the Bernard Kirk body, but the other 5 kinds of insect vector disease pathogens were detected respectively: dog heart filariasis (positive rate 22.5%), canine liver tutua (37.5%), Babes worm (25%), flat no plasma (7.5%), dog Erik subbody (50%).9 only dog (22.5%) of the whole blood nucleic acid did not detect the pathogen of insect vector disease, 14 (35%) Infection has a pathogen, 11 (27.5%) infected two pathogens, 4 (10%) infected with three pathogens, 1 (2.5%) infected with five pathogens. This study successfully established a set of EIC based on the HMBS gene FRET-qPCR system, the system has high sensitivity and specificity, and can realize the whole process monitoring of the PCR detection process, and it is suitable for all nursing. DNA samples of mammary animals. For the first time in the molecular epidemiology investigation of canine vector diseases, this study was the first to report the presence of the jir BABEI in Central America. The results also showed that the prevalence of canine vector diseases in Nicaragua and Costa Rica was very common, and some diseases could infect humans.

【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q503;S855

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本文編號：1883917