本文選題：肺炎克雷伯菌 + 分離��； 參考：《甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,K.pneumoniae)是腸桿菌科克雷伯菌屬的一種常見條件性致病菌,也是一種重要的人獸共患病原菌,其感染僅次于大腸桿菌和綠膿桿菌。目前,該菌呈世界性分布,主要存在于人和動物的腸道、呼吸道和泌尿生殖道及水、土壤和谷物中,當(dāng)機體免疫力低下或長期大量使用抗菌素導(dǎo)致菌群失調(diào)時可引起肺炎、腸炎、腦膜炎、腹膜炎、眼炎以及泌尿生殖道炎癥等多種疾病等,嚴(yán)重的甚至?xí)l(fā)敗血癥。近年來,由于抗生素在臨床上長期、廣泛的使用,使得肺炎克雷伯菌的耐藥菌株不斷增多,給臨床抗感染治療帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。因此,開展肺炎克雷伯菌相關(guān)的研究,將為該菌感染相關(guān)疾病防治新方法及新措施的研究和開發(fā)奠定基礎(chǔ)。本研究以發(fā)生新生犢牛腹瀉和呼吸道癥狀為主疫情的甘肅省蘭州市榆中縣某牛場病死犢牛內(nèi)臟組織為病料,通過病原的分離及鑒定,確定該次疫情是由肺炎克雷伯菌感染所致�；诖�,對分離菌株生物學(xué)特性進行了研究,最后對其基因組進行了生物信息學(xué)的初步分析,從而為肺炎克雷伯菌致病機制及免疫機理的深入研究奠定了一定基礎(chǔ)。研究內(nèi)容及結(jié)果主要包括如下幾個方面。1.肺炎克雷伯菌YZ株的分離及鑒定基于臨床綜合診斷,從送檢病料中進行了病原菌的分離,并在純化的基礎(chǔ)上完成了致病性試驗、藥敏試驗、生化試驗、16S rRNA基因、khe基因及部分毒力基因的擴增及序列分析。結(jié)果表明,除H2S試驗外,分離菌其他生化特征均符合肺炎克雷伯菌,且其16S rRNA基因和khe基因序列與所有已知序列的肺炎克雷伯菌的同源性均高達99%,而該菌三種不同毒力基因的序列與肺炎克雷伯菌其他菌株的同源性亦高達95%以上。基于此,確定分離菌為肺炎克雷伯菌,且將其定名為YZ株。2.肺炎克雷伯菌YZ株的生物學(xué)特性研究在分離及鑒定的基礎(chǔ)上,完成了該菌莢膜染色特性,生長曲線測定,生物被膜形成的檢測,半數(shù)致死量的測定及免疫保護性試驗等的研究。結(jié)果顯示:分離菌不能有效形成莢膜;從繪制的生長曲線可以看出該分離菌在0~4 h處于遲緩期,4 h后進入對數(shù)期生長期,10~18 h為穩(wěn)定期,18 h以后進入衰亡期;生物被膜的定性和定量測定結(jié)果顯示該分離菌能夠形成一定的生物膜;經(jīng)寇氏改良法計算,得知該菌的半數(shù)致死量為1.38×108 CFU,毒力相對較弱;分離菌培養(yǎng)物滅活后按不同濃度(1×107 cfu/mL~1×1010 cfu/mL)配制疫苗,接種小白鼠后未出現(xiàn)異�，F(xiàn)象,說明所配疫苗安全性良好;攻毒試驗表明當(dāng)配苗濃度為1×1010 cfu/mL時,保護率即可達到100%,表明分離菌具有良好的免疫保護作用,且免疫后小鼠抗血清ELISA效價高達1:3 200以上。3.肺炎克雷伯菌YZ株的基因組分析為了解分離菌莢膜缺陷的原因及其致病機制,本研究完成了其基因組框架圖并對測序結(jié)果進行了初步分析。結(jié)果顯示,分離菌基因組長度為5 336 251 bp,GC含量為57.444%,含有120個Scaffold,166個Contig,共預(yù)測到80個tRNA,3個rRNA,基因組中共含有5 205個基因,通過與該屬其他菌株比對,發(fā)現(xiàn)該菌中與莢膜多糖的轉(zhuǎn)移和表面裝配有關(guān)的四個保守基因中缺少wzb基因與wzc基因。另外,在莢膜合成中起不同作用的調(diào)控子中,僅發(fā)現(xiàn)負調(diào)控作用基因Fur、crp和SugE的存在。而毒力基因中,未發(fā)現(xiàn)rmpA、magA、wabG等基因,且在眾多預(yù)測基因中還存在一些功能未知的基因。上述結(jié)果為進一步研究分離菌莢膜形成缺陷的原因及闡明其致病機制奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Klebsiella pneumoniae (Klebsiella pneumoniae, K.pneumoniae) is a common conditional pathogenic bacteria of the genus Enterobacteriaceae. It is also an important zoonosis. The infection is second only to Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. At present, the bacterium is distributed worldwide, mainly in the intestines, respiratory and urinary tract of human and animal. There are many diseases such as pneumonia, enteritis, meningitis, peritonitis, ophthalmia, and urogenital tract inflammation, etc. in colonies and water, soil and grain, which can cause pneumonia, enteritis, meningitis, peritonitis, and urogenital tract inflammation. The increasing number of resistant strains of Klebsiella pneumoniae has brought a severe challenge to the clinical anti infection treatment. Therefore, the study of Klebsiella pneumoniae will lay the foundation for the research and development of new methods and measures for the prevention and treatment of the infection related diseases. The diseased calf viscera of a cattle farm in Yuzhong County, Lanzhou, Gansu Province, was used as the disease material. Through the isolation and identification of the pathogen, it was determined that the epidemic was caused by Klebsiella pneumoniae infection. Based on this, the biological characteristics of the isolated strains were studied. Finally, the preliminary analysis of the bioinformatics was carried out on the genome of the isolated strain. A certain basis was laid on the pathogenesis and immune mechanism of primary bacteria. The research content and results mainly include the separation and identification of the YZ strain of Klebsiella pneumoniae (.1.), based on the clinical comprehensive diagnosis, the isolation of pathogenic bacteria from the sick material, and the pathogenicity test and drug sensitivity test on the basis of purification. Biochemical tests, the amplification and sequence analysis of the 16S rRNA gene, Khe gene and some virulence genes. The results showed that, except for the H2S test, the other biochemical characteristics of the isolated bacteria were all conformed to Klebsiella pneumoniae, and the 16S rRNA gene and the Khe gene sequence were 99% of the homology of all the known sequence of Klebsiella pneumoniae, and three different virulence of the bacteria. The homology of the gene sequence was more than 95% with the other strains of Klebsiella pneumoniae. Based on this, the isolation bacteria was identified as Klebsiella pneumoniae and the biological characteristics of the YZ strain.2. Klebsiella pneumoniae strain YZ strain were identified, and the membrane staining characteristics, growth curve and biofilm form were completed. The results showed that the isolated bacteria could not effectively form a capsule; from the drawn growth curve, we can see that the isolate was in the slow period of 0~4 h, after 4 h and entered the logarithmic period of growth, 10~18 h was a stable period, and after 18 h, it entered the decline period; the qualitative and determination of the biofilm was determined. The results showed that the isolated bacteria could form a certain biofilm, and the median lethal dose of the bacteria was 1.38 * 108 CFU, and the virulence was relatively weak. The vaccine was prepared by different concentrations (1 * 107 cfu/mL~1 x 1010 cfu/mL) after inactivation of the isolated bacteria, and there was no abnormal phenomenon after inoculation of the mice. The toxicity test showed that when the concentration of the vaccine was 1 * 1010 cfu/mL, the protection rate could reach 100%, indicating that the isolated bacteria had a good protective effect. The genomic analysis of the ELISA titer of the antiserum of mice up to more than 1:3 200 of the YZ strain of Klebsiella pneumoniae was to understand the cause and pathogenicity of the capsule defect of the isolated bacteria. The genome length of the genome was completed and the sequencing results were preliminarily analyzed. The results showed that the genome length of the isolated bacteria was 5336251 BP, the content of GC was 57.444%, 120 Scaffold and 166 Contig were contained, and 80 tRNA and 3 rRNA were predicted, and 5205 genes were found in the genome, and found by comparison with the other strains of the genus. The four conserved genes associated with the transfer and surface assembly of capsular polysaccharide are lack of WZB and WZC genes. In addition, only negative regulatory genes, Fur, CRP and SugE, are found in the regulation subsets of different roles in the capsule synthesis, and no rmpA, magA, wabG and other genes are found in the virulence genes, and also in many predictive genes. There are some genes with unknown functions. The above results laid a foundation for further study on the causes of capsule forming defects and elucidating their pathogenic mechanism.

【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.61

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本文編號：1879406