本文選題：禽致病性大腸桿菌 + DNA芯片��； 參考：《揚(yáng)州大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：致病性大腸桿菌可以分為腸道內(nèi)致病性大腸桿菌(intestinal pathogenicEscherichia coli)和腸道外致病性大腸桿菌(Extraintestinal pathogenic E.coli,ExPEC)兩類。禽致病性大腸桿菌(avian pathogenicEscherichia coli,APEC)屬于ExPEC中的一種,可以通過呼吸道途徑感染禽類從而引起多系統(tǒng)損傷綜合征。該病給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,己成為危害養(yǎng)禽業(yè)的重要細(xì)菌病之一,因此,如何防控該病成為養(yǎng)禽業(yè)面臨的一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。此外,APEC與引起人類尿道感染的尿道致病性大腸桿菌(Uropathogenic E.coli,UPEC)具有很大的相似性,因而APEC目前也被認(rèn)為是一種食源性的病原菌,具有重要的公共衛(wèi)生意義。DNA芯片是一種穩(wěn)定、實(shí)用、可行的全基因組分析方法,能夠探索病原體的分子致病機(jī)制,還可以分析細(xì)菌病原體在與宿主相互作用時(shí)的全局基因表達(dá)模式,有助于識(shí)別毒力因子及其對(duì)應(yīng)的調(diào)控機(jī)制。本研究選取APEC 02血清型代表性菌株E058為模式菌株,利用DNA 芯片研究其在感染雞體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄組學(xué),通過數(shù)據(jù)分析篩選差異表達(dá)基因,并對(duì)潛在的毒力基因進(jìn)行研究,擬通過本研究弄清APEC在感染宿主體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜,并進(jìn)一步挖掘潛在的毒力基因,為揭示APEC的致病機(jī)理提供理論依據(jù)。1.基于DNA芯片分析APEC E058株在感染雞體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜本研究選擇代表性的APEC分離株E058,感染1日齡無特定病原體(specificpathogen free,SPF)雞,從感染雞血液中收集菌體,并以E058株在體外LB培養(yǎng)條件下的菌體作對(duì)照,以包含UPEC代表性菌株CFT073以及非致病性菌株K12全基因組序列的商品化 DNA 芯片(Affymetrix GeneChip(?)E.coli Genome 2.0 Array),在全基因組范圍內(nèi),測(cè)定APEC E058株在感染雞體內(nèi)、外基因的表達(dá)水平,從而揭示APEC在感染宿主體內(nèi)的基因表達(dá)規(guī)律。結(jié)果顯示,APEC E058株在感染雞體內(nèi)表達(dá)顯著上調(diào)的基因共有245個(gè),顯著下調(diào)基因共有369個(gè),差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)菌生理代謝、鐵攝取轉(zhuǎn)運(yùn)、毒力、壓力應(yīng)激和生物學(xué)調(diào)控等方面。根據(jù)基因芯片分析結(jié)果選取了 12個(gè)差異表達(dá)基因(8個(gè)上調(diào)和4個(gè)下調(diào)基因)經(jīng)熒光定量PCR分析來驗(yàn)證芯片分析獲得的數(shù)據(jù),結(jié)果表明熒光定量PCR確定所選基因的表達(dá)水平與基因芯片的結(jié)果一致,由此可以確定基因芯片結(jié)果的可靠性。同時(shí),依據(jù)芯片結(jié)果,篩選APEC E058株在體內(nèi)表達(dá)顯著上調(diào)的基因yjiY,sodA,phoB和spy,運(yùn)用基因敲除技術(shù)進(jìn)行缺失突變,通過比較親本株和突變株對(duì)1日齡雛雞的致病力,初步了解和推測(cè)所選基因?qū)χ虏⌒苑矫娴挠绊�。結(jié)果顯示,APEC E058的毒力并未因yjiY,phoB和spy基因的缺失而下降,但是sodA缺失后,APECE058對(duì)雛雞的致病力顯著下降,表明sodA可能作為潛在的毒力基因參與APEC的致病進(jìn)程,接下來進(jìn)一步對(duì)sodA基因的功能和致病力進(jìn)行評(píng)價(jià)。該研究對(duì)于明確目標(biāo)基因在體內(nèi)的表達(dá)水平與其致病作用間的關(guān)系,即在體內(nèi)表達(dá)水平明顯上調(diào)的基因是否為真正毒力基因提供依據(jù)。2.禽致病性大腸桿菌sodA突變株的構(gòu)建及其致病性研究超氧化物歧化酶SodA作為一種抗氧化應(yīng)激因子,在細(xì)菌抗吞噬細(xì)胞的氧化效應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。它對(duì)于APEC毒力的直接影響至今還未見報(bào)道。本研究旨在研究抗氧化相關(guān)基因sodA與APEC致病性之間的關(guān)系,為揭示APEC的致病機(jī)理及進(jìn)一步構(gòu)建APEC弱毒疫苗株奠定基礎(chǔ)。本文運(yùn)用λ Red重組系統(tǒng)構(gòu)建E058ΔsodA基因缺失突變株,之后將帶有相應(yīng)啟動(dòng)子的sodA基因完整閱讀框插入到低拷貝質(zhì)粒pACYC184中,通過電轉(zhuǎn)化突變株來篩選獲得回復(fù)株。生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果顯示,在LB培養(yǎng)基中,突變株生長(zhǎng)速度與野生株E058相似,并未表現(xiàn)出明顯差異,但在含H2O2的LB培養(yǎng)基中,E058ΔsodA突變株的生長(zhǎng)速度顯著低于野生株;體外競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)結(jié)果顯示,在LB培養(yǎng)基中,突變株表現(xiàn)為輕度致弱;血清殺菌試驗(yàn)表明突變株和野生株對(duì)SPF雞血清殺菌作用不敏感;菌株生物被膜檢測(cè)結(jié)果顯示突變株的被膜形成能力與野生株相當(dāng);體外模擬體內(nèi)環(huán)境應(yīng)激條件下的細(xì)菌存活實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,突變株對(duì)H2O2比較敏感,而對(duì)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高滲透壓、尿素等環(huán)境均不敏感;雞巨噬細(xì)胞HD-11細(xì)胞吞噬與胞內(nèi)細(xì)菌增殖試驗(yàn)結(jié)果顯示,與野生株相比,突變株E058ΔsodA對(duì)HD-11細(xì)胞抗吞入和定植能力均下降;半數(shù)致死量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與野生株相比,突變株的致病力下降約100倍;35日齡的SPF雞體內(nèi)定居與持續(xù)試驗(yàn)結(jié)果表明,E058ΔsodA突變株在各臟器的定居與持續(xù)能力均低于野生株E058。上述結(jié)果表明,SodA是APEC的一種重要的毒力因子,對(duì)其致病性起著關(guān)鍵的作用。
[Abstract]:The pathogenic E . coli can be divided into two types : intestinal pathogenicEscherichia coli and extraintestinal pathogenic E . coli and ExPEC . The results showed that the gene expression level of APEC E058 strain was significantly higher than that of wild strain E058 . The results showed that the pathogenicity of mutant strain E058 螖so3 decreased by about 100 times compared with wild strain . The results showed that , compared with wild strain , the pathogenicity of mutant strain E058 螖so3 decreased by about 100 times .

【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.61

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1858196