本文選題：BVDV + miR-2459��； 參考：《石河子大學》2017年碩士論文

【摘要】：至今為止,有關BVDV導致易感動物感染方面的分子機制還不十分明確,BVDV與被感染宿主的細胞之間存在何種相互關聯(lián)的機理仍處于探究階段。故本實驗室在前期的研究中使用solexa高通量測序檢測了BVDV感染靶細胞MDBK后的miRNA表達譜,結果顯示:感染BVDV的MDBK細胞中miR-2459的表達量顯著性升高。通過生物信息學預測軟件分析發(fā)現(xiàn)miR-2459靶向于鋅指抗病毒蛋白基因ZAP。在此基礎上,本實驗研究以miR-2459為研究對象,探究miR-2459如何影響B(tài)VDV復制?ZAP在其中發(fā)揮何種作用?進而為闡述BVDV的持續(xù)性感染和BVDV防控新方法奠定了理論基礎。目的:為探究miR-2459促進BVDV復制的分子機制。對實驗室BVDV感染的MDBK細胞高通量測序的結果進行了分析,選取了表達量顯著性上調(diào)的miR-2459來進行后續(xù)的研究。方法:⑴BVDV感染MDBK細胞短期后,使用Stem-loop RT-PCR的方法鑒定細胞中miR-2459的表達水平;轉(zhuǎn)染miR-2459模擬物和抑制劑,RT-PCR和Reed-Münch法檢測BVDV的復制水平。⑵生物信息學軟件預測miR-2459的靶基因;雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炶b定miR-2459能直接靶向于ZAP 3’UTR區(qū)域;轉(zhuǎn)染miR-2459模擬物和抑制劑,RT-PCR檢測miR-2459對ZAP表達的影響;RT-PCR檢測BVDV NADL侵染MDBK細胞后靶細胞中ZAP的表達水平。⑶構建ZAP的過表達載體p LEX EGFP-ZAP;在HEK-293細胞上采用鈣轉(zhuǎn)的方式包被慢病毒;使用慢病毒侵染MDBK細胞,使用嘌呤霉素在細胞的傳代中對細胞不斷的篩選,以期獲得穩(wěn)定過表達ZAP的MDBK細胞系;BVDV感染過表達ZAP的MDBK細胞后,RT-PCR和Reed-Münch法測定miR-2459對BVDV復制水平的影響。結果:⑴Stem-loop RT-PCR的方法鑒定得到,BVDV感染MDBK細胞短時間內(nèi),細胞內(nèi)miR-2459的表達水平呈上升趨勢;MDBK細胞中轉(zhuǎn)染miR-2459模擬物和抑制劑后,再感染BVDV病毒后,miR-2459對BVDV復制起促進作用。⑵使用生物信息學軟件預測到miR-2459的靶基因是抗病毒相關的鋅指抗病毒蛋白基因ZAP;雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炶b定出miR-2459直接靶向于ZAP的3’UTR區(qū);分別轉(zhuǎn)染miR-2459的模擬物和抑制劑后,miR-2459對ZAP m RNA的表達有抑制作用;BVDV NADL侵染的靶細胞中,ZAP m RNA水平呈下降趨勢。⑶成功構建出ZAP過表達載體p LEX EGFP-ZAP;成功包被出慢病毒并獲得了穩(wěn)定過表達ZAP的MDBK細胞系;RT-PCR和Reed-Münch法檢測發(fā)現(xiàn)過表達ZAP的MDBK細胞對BVDV的復制有極顯著地抑制作用。結論:miR-2459直接靶向于鋅指蛋白ZAP的3’UTR區(qū)域,并影響ZAP的表達水平,從而間接抑制細胞的抗病毒作用,在BVDV的復制過程中發(fā)揮促進的作用。
[Abstract]:鑷充粖涓烘,鏈夊叧BVDV瀵艱嚧鏄撴劅鍔ㄧ墿鎰熸煋鏂歸潰鐨勫垎瀛愭満鍒惰繕涓嶅崄鍒嗘槑紜，

本文編號：1848904