本文選題：PRV變異株 + 豬細(xì)小病毒　； 參考：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)和偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)是影響?zhàn)B豬業(yè)生產(chǎn)的重要病原,兩者均可引起母豬的繁殖障礙疾病,出現(xiàn)如發(fā)情延遲,流產(chǎn),產(chǎn)死胎、木乃伊胎、弱仔等癥狀。本研究以PRV基因工程弱毒株rPRVSMX為載體,構(gòu)建了表達(dá)PPV VP2基因的重組偽狂犬病病毒(rPRVSMX-VP2)。通過一系列實(shí)驗(yàn)研究重組毒株的生物學(xué)特性和免疫原性,以期為PPV和PRV二聯(lián)基因工程疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ),為臨床簡化疫苗免疫程序,提高生產(chǎn)效率提供產(chǎn)品。主要研究內(nèi)容如下:1.PPV毒株的篩選和VP2基因的克隆本研究選取本實(shí)驗(yàn)室保存的8株P(guān)PV毒株,接種ST細(xì)胞后出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變,表現(xiàn)為細(xì)胞拉網(wǎng)、變圓脫落。PCR擴(kuò)增8株病毒的VP2基因,并進(jìn)行測序。使用Bio Edit和MEGA軟件對VP2蛋白氨基端序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn):不同分離株的VP2蛋白氨基酸同源性較高,僅有個(gè)別氨基酸位點(diǎn)存在差異,不同國家PPV毒株的變異位點(diǎn)不同,國內(nèi)分離毒株相似性更高。而分析國內(nèi)分離的病毒,這些毒株VP2基因的變異和其所處的地區(qū)也可能有一定的關(guān)系。進(jìn)化樹分析顯示PPV共分4個(gè)亞型,除了HL株是與德國株相近的基因亞型,其他中國分離株均屬于基因亞型I,本研究選擇分離自湖北武漢的JB株來進(jìn)行VP2基因的克隆。2.重組毒株rPRVSMX-VP2的構(gòu)建以pcDNA3.1(+)為骨架,分別插入PRV TK基因上下游同源臂和VP2表達(dá)盒基因,構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pc DNA3.1-LR-VP2;PRV親本的缺失毒株rPRVSMX由本實(shí)驗(yàn)室胡睿銘博士構(gòu)建。將線性化的重組質(zhì)粒pc DNA3.1-LR-VP2和rPRVSMX基因組DNA采用脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞,待細(xì)胞病變后收毒。在PK-15細(xì)胞上通過5輪空斑純化篩選出不帶熒光的重組病毒rPRVSMX-VP2,通過PCR鑒定和目的片段的測序證明了rPRVSMX-VP2構(gòu)建成功并純化。3.重組毒株rPRVSMX-VP2的特性研究將rPRVSMX-VP2接種PK-15細(xì)胞,進(jìn)行Western Blot試驗(yàn),在rPRVSMX-VP2的泳道中可以觀察到一條約64k D大小特異性條帶,但在對照載體毒rPRVSMX和PK-15細(xì)胞泳道中卻沒有。IFA試驗(yàn)顯示,接種rPRVSMX-VP2的樣品中病變的細(xì)胞中可以觀察到特異性綠色熒光。Western Blot和IFA試驗(yàn)均證明rPRVSMX-VP2在細(xì)胞中成功表達(dá)了VP2蛋白。將重組病毒以MOI為1接種PK-15細(xì)胞,每隔4h進(jìn)行收毒,至接毒后40h,測定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的病毒滴度,結(jié)果證明重組毒株rPRVSMX-VP2的增殖特性和載體毒一致,無顯著性差異,且在接毒后32h,其最高毒價(jià)可以達(dá)到108.2TCID50/ml。4.重組毒株rPRVSMX-VP2在小鼠上的免疫原性試驗(yàn)小鼠安全性試驗(yàn)證明rPRVSMX-VP2對小鼠是安全的,以10TCID50的滴度接種小鼠足墊也不會(huì)導(dǎo)致小鼠死亡。將rPRVSMX-VP2以106.0TCID50的滴度接種小鼠,14d后進(jìn)行加強(qiáng)免疫,結(jié)果表明:rPRVSMX-VP2可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生與載體毒相當(dāng)水平的PRV抗體;而在一免后40d,其所誘導(dǎo)產(chǎn)生的PPV血凝抑制抗體(HI抗體)可達(dá)到1:27,低于PPV商品化疫苗。5.重組毒株rPRVSMX-VP2在豬上的免疫原性試驗(yàn)豬的免疫原性試驗(yàn)結(jié)果與小鼠試驗(yàn)相似,將rPRVSMX-VP2和rPRVSMX以107.0TCID50的滴度接種實(shí)驗(yàn)豬,一免后21d加強(qiáng)免疫一次。一免后,rPRVSMX-VP2組和rPRVSMX組的PRV中和抗體水平迅速升高,35d時(shí)分別可達(dá)到1:23.27±6.92和1:24.87±5.20,無顯著性差異;而兩組的g B-ELISA抗體在免疫后35d和56d也保持相近的水平。rPRVSMX-VP2所產(chǎn)生的PPV抗體略低于商品化滅活疫苗,一免后ELISA抗體和HI抗體都開始增長,至免疫后56d時(shí),rPRVSMX-VP2組PPV HI抗體為1:192±73.9,低于PPV商品化滅活疫苗免疫后所產(chǎn)生的HI抗體(1:320±128)。
[Abstract]:Porcine parvovirus ( PPV ) and pseudorabies virus ( PRV ) were important pathogens affecting the production of VP2 gene . The results showed that the VP2 gene of VP2 gene was constructed by using the recombinant plasmid pcDNA 3.1 - LR - VP2 and rPRVSMX . The results showed that rPRVSMX - VP2 was safe to mice . The results showed that rPRVSMX - VP2 was safe to mice . The results showed that rPRVSMX - VP2 was safe to mice .

【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1811852