發(fā)布時間：2018-04-27 02:00

  本文選題：銅綠假單胞菌 + 外膜蛋白��； 參考：《四川農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：銅綠假單胞桿菌一直以來是困擾野生動物養(yǎng)殖的一大難題,屬較難防控的細(xì)菌性疾病之一。該菌具有較強的耐藥性,感染機體后,可產(chǎn)生多種毒力因子,其具有很強的致病作用,單獨使用抗生素的治療效果并不理想,這限制了抗生素的廣泛使用。因此,合理的疫苗接種對該疫病的預(yù)防起著至關(guān)重要的作用。目前,我國還沒有針對銅綠假單胞菌病的有批文的疫苗。本研究根據(jù)林麝養(yǎng)殖場銅綠假單胞菌的分布情況,通過動物攻毒試驗,成功篩選出了一株毒力最強的菌株作為試驗菌株。經(jīng)提取和純化該菌株的外膜蛋白,并進行免疫接種,從細(xì)胞免疫、體液免疫和攻毒保護三個方面來評估該菌株的免疫原性,并對免疫效果進行評價,以期為林麝銅綠假單胞菌病的防控提供參考依據(jù)。本文所開展的研究和取得的結(jié)果如下：1.試驗菌株的篩選試驗選取本實驗室從林麝體內(nèi)分離并保存的7株銅綠假單胞菌,并均用同一菌液濃度對試驗小鼠進行攻毒,從中篩選出一株毒力最強的菌株(sp-19株),最終,測得其對小鼠的LDso是6.7114×106 CFU。2.外膜蛋白的純化及鑒定通過試劑盒提取sp-19株的外膜蛋白。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析,顯示該方法提取的外膜蛋白有8個蛋白條帶,其分子量分別約為104 KD、71 KD、52 KD、43 KD、36KD、 22KD、18 KD和9 KD。免疫印跡結(jié)果顯示,這些外膜蛋白均能與抗銅綠假單胞菌sp-19株陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng),具有良好的反應(yīng)原性。3.外膜蛋白免疫效果評價分別將試劑盒提取的sp-19株純化外膜蛋白、sp-19株全菌制備的免疫原和超聲破碎提取的sp-19株外膜蛋白免疫實驗小鼠。在四免后,采用間接ELISA的方法檢測試驗小鼠的抗體動態(tài)變化,結(jié)果顯示,各抗原免疫組小鼠體內(nèi)抗體滴度隨免疫進程持續(xù)升高。其中,試劑盒提取的sp-19株純化外膜蛋白抗原組小鼠的抗體水平最高,sp-19株全菌制備的免疫原組和超聲破碎提取的sp-19株外膜蛋白抗原組次之,其效價分別達到1：12500、1：2500和1：500。體外淋巴細(xì)胞增殖試驗表明,sp-19株外膜蛋白能顯著促進各抗原免疫組的小鼠T、B淋巴細(xì)胞的增殖,其增殖率分別為3.05、2.51和1.33：采用細(xì)胞因子檢測試劑盒對免疫0、15、29、43和50天各抗原免疫組小鼠血液中的IL-4和IFN-y進行檢測,其含量最高達104pg/ml、87 pg/ml.66 pg/ml和134pg/ml、131 pg/ml和97 pg/ml。4.外膜蛋白免疫保護性研究分別用試劑盒提取的sp-19株純化外膜蛋白、sp-19株全菌制備的免疫原和超聲破碎提取的sp-19株外膜蛋白免疫小鼠,二免后用5倍LDso的sp-19株活菌經(jīng)腹腔攻毒,結(jié)果顯示,試劑盒提取的sp-19株純化外膜蛋白保護率為87.5%,sp-19株全菌制備的免疫原保護率為62.5%,超聲破碎提取的sp-19株外膜蛋白保護率僅為12.5%,生理鹽水對照組和佐劑對照全部死亡。被動免疫試驗中,先分別將各抗原組免疫56天后的高免血清0.2 ml腹腔注射于小鼠體內(nèi),2h后用2倍LDso的銅綠假單胞菌sp-19株活菌經(jīng)腹腔攻毒。結(jié)果顯示,試劑盒提取的sp-19株純化外膜蛋白保護率為100%,全菌制備的免疫原保護率為87.5%,超聲破碎提取的sp-19株外膜蛋白為僅25%,生理鹽水對照組全部死亡。
[Abstract]:Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa) has been a difficult problem in wild animal breeding. It is one of the most difficult and resistant bacterial diseases. It has strong resistance. After infection, it can produce a variety of virulence factors. It has a strong pathogenic effect. The treatment effect of antibiotics alone is not ideal, which restricts the widespread of antibiotics. Therefore, a reasonable vaccination plays a vital role in the prevention of the disease. At present, there is no vaccine against Pseudomonas aeruginosa in China. According to the distribution of Pseudomonas aeruginosa in the forest musk farm, a strain with the strongest virulence has been successfully screened by the animal attack test. The outer membrane protein of the strain was extracted and purified, and the immunization was carried out. The immunogenicity of the strain was evaluated from three aspects of cell immunity, humoral immunity and attack of poison, and the immune effect was evaluated in order to provide reference for the prevention and control of Pseudomonas aeruginosa in forest musk deer. The results are as follows: 1. the screening test of the test strain selected 7 strains of Pseudomonas aeruginosa isolated and preserved from the musk deer in our laboratory, and used the concentration of the same bacteria to attack the test mice and screened out a strain of the strongest virulence (sp-19 strain). Finally, it was found that the LDso of the mice was 6.7114 * 106 CFU.2. outer membrane protein. The outer membrane protein of sp-19 strain was extracted and identified by the kit. The SDS-PAGE electrophoresis analysis showed that the extraction of the outer membrane protein had 8 protein bands, and its molecular weight was about 104 KD, 71 KD, 52 KD, 43 KD, 36KD, 22KD, 18 KD and 9 KD. showed that all these outer membrane proteins could be positive with the sp-19 strain of Pseudomonas aeruginosa. The specific response of the serum has a good response to the reactivity of the.3. outer membrane protein. The immunogenicity of the sp-19 strain, the immunogen prepared by the sp-19 strain and the outer membrane protein of the sp-19 strain extracted by the ultrasonic fragmentation of the immune test mice, was evaluated respectively. The indirect ELISA method was used to detect the experimental mice after four immunization. The antibody dynamic changes showed that the antibody titer of the mice in the antigen immunization group increased with the immune process. The antibody level of the sp-19 strain extracted by the kit was the highest, the immunogen prepared by the sp-19 strain and the outer membrane protein antigen of the sp-19 strain extracted by the ultrasonic fragmentation were the group. The proliferation test of 1:12500,1:2500 and 1:500. in vitro showed that the outer membrane protein of sp-19 strain could significantly promote the proliferation of T and B lymphocytes in the antigen immunized mice, and the proliferation rate was 3.05,2.51 and 1.33, respectively. The cytokine detection kit was used to immunize 0,15,29,43 and I in the blood of each antigen immunized group of 50 days. L-4 and IFN-y were tested with the highest content of 104pg/ml, 87 pg/ml.66 pg/ml and 134pg/ml, 131 pg/ml and 97 pg/ml.4. outer membrane proteins, the immune protective study of the outer membrane protein extracted with the reagent box, the immunogen prepared by the sp-19 strain and the sp-19 strain of the ultrasonic breakage of the outer membrane protein, was immunized with the 5 times LDso. The results showed that the protective rate of the purified outer membrane protein extracted from the sp-19 strain of the kit was 87.5%, the immunogen protection rate of the sp-19 strain was 62.5%, the protection rate of the outer membrane protein of the sp-19 strain extracted by ultrasonic fragmentation was only 12.5%, and the normal saline control group and the adjuvant control were all dead. Don't intraperitoneally injecting high serum free serum 0.2 ml from each antigen group for 56 days. After 2h, the sp-19 strain of Pseudomonas aeruginosa with 2 times LDso was used in the abdominal cavity. The results showed that the protection rate of the purified outer membrane protein extracted by the kit was 100%, the immune Yuan Bao protection rate of the whole bacteria was 87.5%, and the outer membrane of the sp-19 strain extracted by ultrasonic breakage was the outer membrane. The protein was only 25%, and all of the normal saline control group died.

【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 付建榮;劉群;張艷紅;劉金偉;劉靜;李建;;銅綠假單胞菌β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥相關(guān)基因研究[J];中國抗生素雜志;2006年07期

2 樂軍;蔣曉飛;梁莉;呂元;;蛋白質(zhì)組學(xué)分析多重耐藥的銅綠假單胞菌[J];中國抗生素雜志;2006年08期

3 王燕;竇恒利;胡成進;;銅綠假單胞菌膠體金免疫層析法的研制和應(yīng)用[J];標(biāo)記免疫分析與臨床;2010年03期

4 戴一平;變異銅綠假單胞菌鑒定[J];江西醫(yī)藥;1997年04期

5 李杰,呂美榮,申曉銘,解士芳;銅綠假單胞菌及其L型醫(yī)院感染180例分析[J];蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報;1998年01期

6 王繼東;王春新;糜祖煌;周麗珍;;一株攜帶三種β內(nèi)酰胺酶基因銅綠假單胞菌的發(fā)現(xiàn)[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2006年07期

7 周惠琴;趙勝;嚴(yán)茹紅;肖燕;朱雪明;;銅綠假單胞菌在重癥監(jiān)護病房分離株氨基糖苷類修飾酶基因研究[J];中華醫(yī)院感染學(xué)雜志;2007年01期

8 陳茶;黃彬;藍(lán)鍇;龐雪云;糜祖煌;;銅綠假單胞菌“泛耐株”耐藥相關(guān)基因研究[J];中國抗生素雜志;2009年02期

9 王結(jié)珍;孫各琴;朱濤;張熾倫;張秀明;羅錫華;吳秀娟;溫羊城;雷杰;;銅綠假單胞菌氨基糖苷類耐藥表型及耐藥基因的檢測[J];中華醫(yī)院感染學(xué)雜志;2011年17期

10 劉文;滕廷波;楊輝紅;陳琳;余建申;涂宜明;關(guān)濤;鄧群;;2010年宜昌市銅綠假單胞菌的耐藥性分析[J];微生物學(xué)雜志;2011年06期

相關(guān)會議論文 前10條

1 丁艷苓;陳亞紅;姚婉貞;寧永忠;;2007年-2009年銅綠假單胞菌的耐藥性分析[A];中華醫(yī)學(xué)會第七屆全國呼吸道感染學(xué)術(shù)大會暨第一屆多學(xué)科抗感染治療學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2011年

2 鄧麗華;許美榮;胡麗萍;;銅綠假單胞菌的耐藥性及β-內(nèi)酰胺酶基因的研究[A];第五次全國中青年檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

3 付建榮;劉群;張艷紅;劉金偉;劉靜;李建;;銅綠假單胞菌燒傷患者分離株β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類耐藥基因研究[A];第四屆全國燒傷救治專題研討會燒傷感染救治新進展論文匯編[C];2006年

4 陳一強;陳海榮;;生物膜形成相關(guān)的銅綠假單胞菌的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第11屆全國內(nèi)科學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2007年

5 曾燕麗;蘭小鵬;江麗;劉豐偉;;滅活銅綠假單胞菌DNA適體的篩選和鑒定[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議資料匯編[C];2008年

6 李超;黃亮;劉慶中;王賽芳;鄭佳音;周鐵麗;;銅綠假單胞菌產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶和外膜蛋白缺失的檢測[A];2008年浙江省檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2008年

7 李小燕;卓超;馮景宇;;低濃度乙醇誘導(dǎo)銅綠假單胞菌毒力基因的表達量變化[A];中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)年會——2011（第十二次全國呼吸病學(xué)學(xué)術(shù)會議）論文匯編[C];2011年

8 李俊娟;蔣捍東;;亞抑菌濃度抗生素對銅綠假單胞菌生物膜形成的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)年會——2011（第十二次全國呼吸病學(xué)學(xué)術(shù)會議）論文匯編[C];2011年

9 李曉玲;高華;劉正祥;;銅綠假單胞菌耐藥性5年連續(xù)監(jiān)測[A];第十屆全軍檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2005年

10 羅燕萍;沈定霞;裴保香;徐雅萍;白立彥;;銅綠假單胞菌耐藥性與五種抗假單胞菌抗生素使用量相關(guān)性分析[A];第五次全國中青年檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

相關(guān)重要報紙文章 前5條

1 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 俞云松;銅綠假單胞菌耐藥全國流行[N];健康報;2008年

2 李曙平;銅綠假單胞菌 老年病房的主要致病菌[N];中國中醫(yī)藥報;2003年

3 王振嶺;銅綠假單胞菌耐藥問題嚴(yán)重[N];中國醫(yī)藥報;2002年

4 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院檢驗科 胡志東;關(guān)注銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物的耐藥[N];健康報;2009年

5 ;碳青霉烯類抗生素[N];農(nóng)村醫(yī)藥報（漢）;2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 孫震;銅綠假單胞菌的耐藥性及耐亞胺培南機制的研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2009年

2 謝才文;銅綠假單胞菌多藥耐藥性分子流行病學(xué)研究[D];廣東藥學(xué)院;2010年

3 盧錦萍;兒童銅綠假單胞菌感染臨床特點及高危因素分析[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

4 張詠梅;落葉松皮素對銅綠假單胞菌生物膜作用的研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2004年

5 劉豐偉;體外篩選銅綠假單胞菌適體的研究及初步應(yīng)用[D];福建醫(yī)科大學(xué);2007年

6 江守偉;2008-2009年安徽省銅綠假單胞菌耐藥性監(jiān)測[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2012年

7 馮軍花;銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥性及部分耐藥機制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2008年

8 李靚;山西太原地區(qū)銅綠假單胞菌的調(diào)查分析及產(chǎn)金屬酶基因型研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2011年

9 王卉;銅綠假單胞菌臨床株產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶及其耐藥性的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2005年

10 顧曉花;紅霉素對銅綠假單胞菌毒力的抑制[D];上海交通大學(xué);2007年

，

本文編號：1808659