本文選題：車前草多糖 + 巨噬細(xì)胞　； 參考：《西南大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：車前草是由《中華人民共和國(guó)藥典》收載的一味常用中草藥。研究發(fā)現(xiàn),從車前草提取純化得到的一類多糖類物質(zhì)——車前草多糖(Plantago asiatica Polysaccharide,PLP)具有清除體內(nèi)自由基、調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬等多種生物學(xué)活性。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),PLP可提高雛雞新城疫疫苗免疫效價(jià)和雛雞淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。一些研究發(fā)現(xiàn),巨噬細(xì)胞可通過其表面受體,如Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)、甘露糖受體(Mannose receptor,MR)、補(bǔ)體3受體(Complement receptor 3,CR3)和β-葡聚糖受體(Dectin-1)等識(shí)別多糖,激活核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(Nuclear factor kappa B,NF-κB)和促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinases,MAP激酶,MAPK)信號(hào)通路,促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和一氧化氮(Nitric oxide,NO),提高其吞噬功能,從而達(dá)到免疫調(diào)節(jié)作用。車前草多糖作為一種重要的中藥多糖其對(duì)固有免疫的作用及其作用機(jī)制鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)以小鼠巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象,運(yùn)用細(xì)胞和分子生物學(xué)技術(shù),研究PLP對(duì)巨噬細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用及其作用機(jī)制。試驗(yàn)結(jié)果如下:1.車前草多糖對(duì)巨噬細(xì)胞免疫功能的影響本試驗(yàn)用不同濃度(20、40、60、80、100、120、160μg/m L)的PLP與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng),并設(shè)脂多糖(LPS)對(duì)照組(1μg/m L)和空白對(duì)照組(只有細(xì)胞不加藥物),每組3個(gè)重復(fù)。PLP或LPS與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后,收集細(xì)胞上清液檢測(cè)NO、IL-6和TNF-α含量;收集細(xì)胞,提取總RNA檢測(cè)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,i NOS)m RNA表達(dá)量;加入中性紅,檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞吞噬中性紅活力;加入MTS檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示,PLP 20、40、60、80、100、120μg/m L和LPS(1μg/m L)可顯著提高巨噬細(xì)胞對(duì)中性紅的吞噬率、促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌NO和顯著提高巨噬細(xì)胞i NOS m RNA的表達(dá)量(P0.01);PLP 20、40、80和160μg/m L均能顯著提高巨噬細(xì)胞IL-6分泌量(P0.01);PLP 20、40、80和160μg/m L均能提高巨噬細(xì)胞TNF-α分泌量,除20μg/m L劑量組外,均顯著高于對(duì)照組(P0.01);20、40、60、80、100、120μg/m L PLP均能顯著提高小鼠巨噬細(xì)胞的增殖率,當(dāng)PLP為100μg/m L時(shí),增殖率達(dá)到峰值,為133.2±7.7%,隨后降低。以上結(jié)果表明PLP可促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌NO、IL-6和TNF-α,提高巨噬細(xì)胞吞噬中性紅和增殖的能力,提示PLP具有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞免疫功能的作用。2.車前草多糖對(duì)巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的作用機(jī)制為進(jìn)一步研究車前草多糖(PLP)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞免疫功能的機(jī)制,本試驗(yàn)檢測(cè)TLR2/4受體在巨噬細(xì)胞識(shí)別PLP中的作用,并研究PLP對(duì)巨噬細(xì)胞NF-κB和MAPK信號(hào)通路的影響,在阻斷TLR2受體和MAPK條件下觀察NF-κB和MAPK兩條信號(hào)通路在PLP調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞免疫功能中的作用關(guān)系。試驗(yàn)用PLP(50μg/m L)與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng),并在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清液,用熒光定量PCR和Western-blot法檢測(cè)TLR-NF-κB和MAPK信號(hào)通路相關(guān)基因m RNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)量;以TLR2抗體(anti-TLR2)和P-ERK阻斷劑(U120)分別阻斷TLR2和P-ERK表達(dá),檢測(cè)巨噬細(xì)胞相應(yīng)基因m RNA和蛋白表達(dá)水平,以及巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的變化情況。試驗(yàn)結(jié)果顯示,PLP刺激巨噬細(xì)胞5 h,TLR2和TLR4的m RNA表達(dá)量均顯著升高(P0.01),且隨著PLP刺激時(shí)間推移表達(dá)量降低,用TLR2抗體阻斷TLR2后,anti-TLR2(25μg/m L)+PLP組TLR2/4m RNA表達(dá)水平分別為1.88±0.18和0.91±0.23較PLP組顯著降低;anti-TLR2(10μg/m L)+PLP和anti-TLR2(25μg/m L)+PLP組TNF-α濃度較PLP組均顯著下降(P0.01),anti-TLR2(10和25μg/m L)處理巨噬細(xì)胞后,PLP不能提高巨噬細(xì)胞TNF-α分泌量;PLP刺激巨噬細(xì)胞后其NF-κB和My D88的m RNA表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高(P0.01),當(dāng)TLR2被阻斷后,NF-κB和My D88 m RNA的表達(dá)量較PLP組均顯著下調(diào)(P0.01);Western-blot結(jié)果顯示,PLP刺激巨噬細(xì)胞15 min和30 min后,其P65蛋白表達(dá)量顯著上調(diào),在1 h后P65蛋白隨即降低至正常水平;ERK1、JNK1和P38m RNA表達(dá)水平在PLP刺激后顯著升高(P0.05),ERK2和JNK2 m RNA表達(dá)水平與對(duì)照組無顯著性差異(P0.05);用anti-TLR2阻斷巨噬細(xì)胞TLR2后,PLP不能引起MAPK三條通路各亞基m RNA表達(dá)水平升高;與對(duì)照組相比,PLP刺激15 min和30 min后,巨噬細(xì)胞ERK1和P-ERK1/2蛋白表達(dá)水平均顯著升高,ERK2蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化,并隨著時(shí)間推移而降低;同時(shí)經(jīng)P-ERK抑制劑U120處理后,PLP刺激巨噬細(xì)胞30 min后不能引起其P-ERK1/2磷酸化水平的升高;經(jīng)P-ERK抑制劑處理后,PLP不能提高NF-κB和My D88 m RNA表達(dá)量,同時(shí)也不能提高巨噬細(xì)胞NF-κB P65蛋白表達(dá)水平,且較PLP處理組差異極顯著(P0.01);當(dāng)用anti-TLR2和U120分別處理細(xì)胞后,PLP誘導(dǎo)的i NOS m RNA表達(dá)量顯著降低(P0.01),但仍顯著高于對(duì)照組(P0.01)。試驗(yàn)結(jié)果提示,巨噬細(xì)胞細(xì)胞對(duì)PLP識(shí)別的主要受體是TLR2;TLR2-My D88-MAPK-NF-κB信號(hào)通路是PLP作用于巨噬細(xì)胞的通路之一;MAPK通路可能參與PLP調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞i NOS的表達(dá)。上述結(jié)果表明,車前草多糖可通過TLR2-MyD88-MAPK-NF-κB信號(hào)通路提高巨噬細(xì)胞分泌、吞噬和增殖能力從而調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞免疫功能;并且可以提高巨噬細(xì)胞ERK1、JNK1、P38和NF-κB蛋白和m RNA表達(dá),提示ERK1、JNK1、P38和NF-κB為車前草多糖的藥理作用靶點(diǎn)。
[Abstract]:In this study , it was found that a kind of polysaccharides , such as Toll - like receptor ( TLR ) , mannose receptor ( MR ) , complement receptor 3 ( CR3 ) and 尾 - glucan receptor ( Dectin - 1 ) , could enhance the immune function of chickens . The expression of TNF - 偽 in macrophages was significantly increased . The results showed that the expression of TNF - 偽 in macrophages was significantly higher than that of control group ( P0.01 ) . After treatment with anti - TLR2 ( 10 渭g / ml ) , the expression levels of NF - 魏B and mRNA were significantly higher than those in the control group ( P0.01 ) . The results showed that TLR2 - MyD88 - MAPK - NF - 魏B signaling pathway was one of the pathways to regulate the secretion , phagocytosis and proliferation of macrophages . The results suggested that the TLR2 - MyD88 - MAPK - NF - 魏B signaling pathway was one of the pathways to regulate the secretion , phagocytosis and proliferation of macrophages . The results suggested that the TLR2 - MyD88 - MAPK - NF - 魏B signaling pathway could increase the immune function of macrophages .

【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S853.74

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1803723