本文選題：C2C12 + skMLCK��； 參考：《錦州醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的通過分別建立sk MLCK基因高、低表達(dá)的小鼠成肌細(xì)胞C2C12穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,采用實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot技術(shù)分析sk MLCK基因?qū)π∈蟪杉〖?xì)胞C2C12肌纖維及其相關(guān)信號(hào)通路中關(guān)鍵成分的影響,初步探討sk MLCK基因影響肌纖維的分子機(jī)制,為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。方法復(fù)蘇本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的sk MLCK高表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng);將最佳干擾效率的sh RNA重組載體轉(zhuǎn)染C2C12中,經(jīng)嘌呤霉素篩選后獲得低表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。采用實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot方法分別檢測(cè)高表達(dá)和低表達(dá)細(xì)胞株中肌纖維組成成分(MLC、α-actin、Myhc slow、Myhc 2a、Myhc 2x和Myhc 2b)和信號(hào)通路關(guān)鍵因子(sk MLCK、CFL2、MEF2C、Ca M、p38、AMPKα2、Rho A)的m RNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)情況統(tǒng)計(jì),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果1、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)sk MLCK高表達(dá)細(xì)胞株m RNA表達(dá)的結(jié)果表明:與空白對(duì)照組相比,肌纖維組成成分中Myhc slow、Myhc 2a、MLC顯著或極顯著升高(p0.05或p0.01),α-actin、Myhc 2x、Myhc 2b極顯著降低(p0.01);信號(hào)通路關(guān)鍵分子MEF2C、Ca M、p38、AMPKα2、Rho A顯著或極顯著降低(p0.05或p0.01);CFL2各組呈現(xiàn)顯著或極顯著降低(p0.05或p0.01)。Western blot檢測(cè)sk MLCK高表達(dá)細(xì)胞株中蛋白質(zhì)表達(dá)的表達(dá)情況結(jié)果表明:與空白對(duì)照組相比,肌纖維組成成分中Myhc 2a與MLC極顯著升高(p0.01);α-actin、Myhc slow、Myhc 2x、Myhc 2b顯著或極顯著降低(p0.05或p0.01);信號(hào)通路關(guān)鍵分子中,MAPKp38、Rho A極顯著升高(p0.01);MEF2C、Ca M、AMPKα2顯著或極顯著降低(p0.05或p0.01);CFL2各組呈現(xiàn)顯著或極顯著降低(p0.05或p0.01)。2、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)sk MLCK低表達(dá)細(xì)胞株m RNA表達(dá)的結(jié)果表明:與空白對(duì)照組相比,肌纖維組成成分中α-actin、MLC、Myhc 2x、Myhc 2b顯著或極顯著升高(p0.05或p0.01);Myhc slow、Myhc 2a極顯著降低(p0.05或p0.01);信號(hào)通路關(guān)鍵分子中,AMPKα2、Rho A極顯著升高(p0.01).CFL2各組呈現(xiàn)顯著或極顯著升高(p0.05或p0.01)。Western blot檢測(cè)sk MLCK低表達(dá)細(xì)胞株中蛋白質(zhì)表達(dá)的表達(dá)情況結(jié)果表明:與空白對(duì)照組相比,肌纖維組成成分中,α-actin、MLC、Myhc 2x、Myhc 2b顯著或極顯著升高(p0.05或p0.01);信號(hào)通路的關(guān)鍵成分中,AMPKα2、Rho A極顯著升高(p0.01);CFL2各組呈現(xiàn)顯著或極顯著升高(p0.05或p0.01)。3、將本實(shí)驗(yàn)中sk MLCK高、低表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株所有蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)合并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),sk MLCK僅與信號(hào)通路Rho A顯著(p0.05)高度相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.818,呈曲線關(guān)系。結(jié)論1、C2C12中,sk MLCK基因通過改變Rho A信號(hào)通路的變化來影響肌纖維的組成。2、sk MLCK對(duì)肌纖維的生長(zhǎng)發(fā)育具有抑制作用;3、sk MLCK抑制CFL2的表達(dá),同時(shí)對(duì)其它信號(hào)通路(AMPK、Ca M和MAPK)也產(chǎn)生影響。
[Abstract]:Objective to establish mouse myoblast stable transformation cell lines with high and low expression of SK MLCK gene, and to analyze the effect of SK MLCK gene on C2C12 muscle fiber and key components of signal pathway in mouse myoblast by real-time quantitative PCR and Western blot. The molecular mechanism of SK MLCK gene affecting muscle fiber was preliminarily discussed, which laid a foundation for further study. Methods after resuscitation of SK MLCK high expression stable transgenic strain obtained in our laboratory, the sh RNA recombinant vector with the best interference efficiency was transfected into C2C12, and the low expression stable transfer cell line was obtained after screening by purine mycin. Real-time quantitative PCR and Western blot were used to detect the expression of m RNA and protein in high expression and low expression cell lines (MLC, 偽 -actinine Myhcslow-Myhc2aHc2x and Myhc 2b) and signal pathway key factor (MLCKL2MEF2CU Ca Mp38AMPK 偽 2Rho A), respectively. Results 1. The expression of m RNA in SK MLCK high expression cell line was detected by real time quantitative PCR. In muscle fiber components, Myhc slow-regulated Myhc2aAMLC significantly or extremely increased p0.05or p0.01a, 偽 -actinine Myhc2xMHC2b significantly decreased p0.01a; signal pathway key molecule MEF2CU Ca M38AMPK 偽 2Rho A significantly or very significantly decreased p0.05or p0.01CFL2 groups showed significant or extremely significant decrease in p0.05 or p0.01).Western blot detection. The results of protein expression in SK MLCK overexpression cell line showed that: compared with the blank control group, Myhc 2a and MLC in muscle fiber components increased significantly (p0.01a); 偽 -actinine Myhc slow (Myhc2x) Myhc2b significantly or extremely significantly decreased p0.05 or p0.01C; MAPKp38 Rho A in signal pathway key molecules increased significantly (p0.01MEF2CU Ca MAMPK 偽 2) or decreased significantly (p0.05 or p0.01) CFL2. The expression of m RNA in SK MLCK low expression cell line was detected by real time quantitative PCR. In the composition of myofiber, 偽 -actinin MLC (MLC) Myhc2x (Myhc2b) significantly or extremely significantly increased p0.05 or p0.01 Myhc2a significantly decreased p0.05 or p0.01a, and the key molecule of signal pathway, AMPK 偽 _ 2 Rho A, increased p0.01g 路CFL2 significantly or significantly increased p0.05 or p0.01).Western blot detection of SK MLCK low. The expression of protein in the expressed cell line showed that: compared with the blank control group, In the composition of myofiber, 偽 -actinine MLC (MLC) Myhc2x (Myhc2x) Myhc2b significantly or extremely increased p0.05 or p0.01a, and the key component of signal pathway, AMPK 偽 _ 2o _ (Rho A) significantly increased p0.01C ~ (2 +) CFL2. The results showed that the MLCK of these two groups was significantly higher than that of control group (p 0.05 or p 0.01 ~ (-1) 路3), and that of the key components of the signal pathway was significantly higher than that of the control group (P < 0.05 or P 0.01U 路3). All the protein expression data of low expression stable cell line were analyzed by statistical correlation analysis. It was found that MLCK was highly correlated with signal pathway Rho A (P 0.05), and the correlation coefficient was 0.818, showing a curve relationship. Conclusion (1) MLCK gene in C2C12 can inhibit the growth and development of muscle fiber by changing the signal pathway of Rho A, and inhibit the expression of CFL2 by MLCK. It also affects the expression of AMPK Ca M and MAPK in other signaling pathways.
【學(xué)位授予單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S828

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本文編號(hào)：1794780