本文選題：產(chǎn)氣莢膜梭菌 + 壞死性腸炎　； 參考：《東北農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)最初是William Hery Welch發(fā)現(xiàn)的,因而又被命名為魏氏梭菌(Clostridium welchii),是一種G+厭氧芽孢桿菌。在繁殖過程中,C.perfringens能產(chǎn)生多種外毒素和酶,并且它們中的大部分都是具有致病作用的。其中Alpha毒素、Beta毒素、Epsilon毒素和Iota毒素是主要的致死毒素,根據(jù)這四種主要毒素可將C.perfringens分為A-E 5個(gè)類型。其中A型C.perfringens可引起雞壞死性腸炎,該病對全球養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失,因而一直是研究的熱點(diǎn)。從1891年C.perfringens被發(fā)現(xiàn)以來,對其致病機(jī)理和有效預(yù)防措施的研究從未間斷,但仍缺乏細(xì)菌-宿主相互作用的信息和有效的疫苗來控制此菌的感染。本研究制備了C.perfringens標(biāo)準(zhǔn)株ATCC13124菌體蛋白樣品,通過雙向電泳對菌體蛋白進(jìn)行分離,并利用全菌多抗進(jìn)行雙向電泳的Western-Blot檢測。經(jīng)過分析,本研究共選取了16個(gè)蛋白點(diǎn),一式兩份進(jìn)行MALDI-TOF-MS和PMF分析,結(jié)果共有14種不同的蛋白被測出,除丙酮酸黃素氧還蛋白還原酶(PFO)與假定蛋白(HP)外,其他12種蛋白均為新鑒定出的免疫原性蛋白,大部分的免疫原性蛋白位于細(xì)胞質(zhì)中,其多具有參與細(xì)胞生長與代謝的功能。本研究選取了半胱氨酸合成酶(cysteine synthase,Cys)、假定轉(zhuǎn)酮酶(putative transketolase,PTC)、乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)以及嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase,PNP)四種免疫原性蛋白,構(gòu)建其原核表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行了蛋白表達(dá),以純化蛋白為抗原制備了多抗,Western-Blot分析表明所制備的四種多克隆抗體均能特異性結(jié)合C.perfringens菌體蛋白,具有很好的反應(yīng)性。同時(shí)構(gòu)建了四種蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒,體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明四種蛋白均有較好的表達(dá),接著以真核表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行動(dòng)物免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,所構(gòu)建的四種重組真核表達(dá)質(zhì)粒均能在不同程度上抵抗C.perfringens的攻擊,降低了雞只腸道病變程度,能刺激機(jī)體產(chǎn)生較好的免疫反應(yīng),其中Cys和PNP兩種免疫抗原能產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)作用。綜上所述,本研究為C.perfringens的疫苗研發(fā)提供了物質(zhì)基礎(chǔ),對雞壞死性腸炎的臨床控制具有重要意義。
[Abstract]:Clostridium perfringens (Clostridium perfringens) was first discovered by William Hery Welch, so it was named Clostridium welchiiana. C. perfringens can produce a variety of exotoxins and enzymes during reproduction, and most of them are pathogenic. Among them, Alpha toxin, Epsilon toxin and Iota toxin are the main lethal toxins. According to these four main toxins, C.perfringens can be classified into 5 types of A-E. Type A C.perfringens can cause necrotizing enteritis in chickens. Since the discovery of C.perfringens in 1891, the research on its pathogenic mechanism and effective preventive measures has been uninterrupted, but there is still a lack of information on bacteria-host interaction and effective vaccine to control the infection of this bacterium. In this study, we prepared the standard C.perfringens strain ATCC13124 cell protein sample, separated the bacterial protein by two-dimensional electrophoresis, and detected the Western-Blot by Western-Blot with whole bacterial polyclonal antibody. After analysis, a total of 16 protein spots were selected for MALDI-TOF-MS and PMF analysis in two copies. The results showed that 14 different proteins were detected, except pyruvate Flavin oxoredoxin reductase and hypothetical protein. The other 12 proteins are newly identified immunogenic proteins, most of which are located in the cytoplasm, and most of them are involved in cell growth and metabolism. In this study, four immunogenicity proteins, cysteine synthase (cysteine synthase), putative transketolase (PTC), ethanol dehydrogenase (ADH) and purine nucleoside phosphorylase (purine nucleoside phosphorylasePNPs), were selected, and their prokaryotic expression plasmids were constructed and expressed. Western-Blot analysis using purified protein as antigen showed that the four polyclonal antibodies could specifically bind to C.perfringens bacterial protein and had good reactivity. At the same time, the eukaryotic expression plasmids of four proteins were constructed. The transient transfection experiments in vitro showed that the four proteins were well expressed, and then the eukaryotic expression plasmids were used for animal immune protection experiments. The results showed that the four recombinant eukaryotic expression plasmids were able to resist the attack of C.perfringens to some extent, reduce the degree of intestinal lesions, and stimulate the body to produce a better immune response. Two immune antigens, Cys and PNP, can produce better immune protection. In conclusion, this study provides a material basis for the research and development of C.perfringens vaccine and is of great significance for the clinical control of necrotizing enteritis in chicken.
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61

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本文編號：1786696