本文選題：禽致病性大腸桿菌 + Ⅲ型分泌系統(tǒng)2　； 參考：《安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：細(xì)菌通過分泌系統(tǒng)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)菌胞外或直接注入宿主細(xì)胞內(nèi),與細(xì)菌的生存及致病性密切相關(guān)。Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TypeⅢsecretion system,T3SS)存在于致病性大腸桿菌、沙門菌等細(xì)菌中,與毒力因子的分泌及致病力有關(guān)。研究人員發(fā)現(xiàn)EHEC O157:H7存在與沙門菌SPI-1類似的毒力島,將其命名為E.coli TypeⅢsecretion system 2(ETT2)。調(diào)查發(fā)現(xiàn),不同致病性大腸桿菌中均含有ETT2毒力島。盡管大部分ETT2毒力島存在基因突變和缺失,其在黏附入侵、胞內(nèi)生存、生物被膜形成等方面發(fā)揮重要作用。APEC(Avian pathogenic E.coli,APEC)屬于腸道外致病性大腸桿菌(Extraintestinal Pathogenic E.coli,ExPEC),可以引起禽大腸桿菌病,給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。研究表明,APEC與人ExPEC基因組結(jié)構(gòu)相似,具有許多相同的毒力因子和相似的致病機(jī)制。因此,APEC是人ExPEC的毒力基因貯庫,對人類健康造成潛在威脅。為了闡明APEC中ETT2的分布及其致病機(jī)制,本研究對APEC中ETT2進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查,并分析ETT2 ATPase EivC關(guān)鍵活性位點(diǎn)及其對APEC致病性的影響,為進(jìn)一步研究ETT2在APEC中的致病機(jī)制提供參考。1.ETT2在APEC中的亞型及流行病學(xué)調(diào)查為了檢測ETT2在APEC中的分布,本研究根據(jù)EHEC O157:H7的ETT2毒力島序列設(shè)計(jì)8對重疊PCR引物,檢測ETT2在APEC臨床分離株中的分布。然后,對ETT2目的條帶進(jìn)行測序,分析ETT2亞型。同時(shí),通過PCR方法鑒定APEC的血清型、進(jìn)化分群,并分析ETT2與血清型、進(jìn)化分群之間的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)57.6%(141/245)APEC分離株含有ETT2毒力島。測序結(jié)果顯示APEC中ETT2分為完整型ETT2(命名為A亞型)和缺失突變型ETT2(命名為B、C、D、E亞型)。血清型分析表明ETT2主要存在于O1、O2和O78血清型APEC中。此外,O78血清型APEC僅含有缺失突變型ETT2,而完整型ETT2主要存在于O1和O2血清型APEC中。分析發(fā)現(xiàn),T3SS相關(guān)基因簇(eip)僅存在于完整型ETT2陽性菌株中。大腸桿菌進(jìn)化分群分析顯示,66.7%(32/48)B1、64.8%(35/54)D、59.6%(31/52)A、44.9%(35/78)B2進(jìn)化分群APEC含有ETT2。然而,ETT2毒力島和其他毒力基因分布沒有關(guān)聯(lián)性。本研究表明,APEC中ETT2的亞型及分布均顯著高于人的ExPEC,進(jìn)一步證明APEC對人類健康造成潛在威脅。2.ETT2毒力島組分EivC克隆表達(dá)及其ATPase活性分析為了分析APEC ETT2毒力島組分EivC的ATPase活性及其關(guān)鍵活性位點(diǎn),本研究比對分析病原菌ATPase序列,分別設(shè)計(jì)克隆表達(dá)引物及點(diǎn)突變引物,然后構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后純化相應(yīng)蛋白,并檢測其ATPase活性。結(jié)果顯示,EivC蛋白包含F(xiàn)0F1 ATPase的保守序列Walker Box A、Walker Box B及DCCD Box,因此EivC可能屬于ATPase。酶活試驗(yàn)結(jié)果顯示,His-EivC融合蛋白具有ATPase活性,磷酸鹽釋放速率為0.28±0.08mmol/min/mg。根據(jù)病原菌ATPase的關(guān)鍵位點(diǎn),選擇EivC蛋白第175位賴氨酸、第199位精氨酸、第201位精氨酸、第233位精氨酸進(jìn)行點(diǎn)突變,然而點(diǎn)突變與野生型EivC的ATPase活性無顯著差異。故本研究表明ETT2毒力島組分EivC為ATPase,但是第175、199、201、233位氨基酸不影響其ATPase活性。3.禽致病性大腸桿菌APCE94 eivC基因缺失株、互補(bǔ)株的構(gòu)建及特性分析為了分析ETT2 ATPase EivC對APEC表型和毒力的影響,本研究利用Red同源重組系統(tǒng)構(gòu)建APCE94的eivC基因缺失株,并利用低拷貝質(zhì)粒pSTV28構(gòu)建eivC基因互補(bǔ)株。然后比較分析野生株、缺失株與互補(bǔ)株的生長特性、運(yùn)動(dòng)性、抗血清殺菌能力、黏附/侵襲能力、HD-11細(xì)胞內(nèi)存活能力、動(dòng)物致病力等差異。通過熒光定量方法檢測APEC鞭毛、菌毛、毒力基因及HD-11細(xì)胞的細(xì)胞因子的表達(dá)水平;并通過透射電子顯微鏡觀察細(xì)菌表面形態(tài)變化。結(jié)果顯示,與野生株相比,eivC缺失株的生長特性無顯著變化,但其運(yùn)動(dòng)性顯著降低。電鏡檢測結(jié)果表明eivC缺失株表面的鞭毛減少,而菌毛增加,從而導(dǎo)致細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性降低,熒光定量PCR結(jié)果顯示鞭毛和毒力基因表達(dá)下調(diào)。另外,eivC缺失導(dǎo)致其抗血清殺菌能力、HD-11胞內(nèi)存活能力顯著下降。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明APEC94ΔeivC對雛鴨的致病力、體內(nèi)存活和定殖能力顯著降低。細(xì)胞炎癥因子熒光定量分析發(fā)現(xiàn)缺失株APEC94ΔeivC感染HD-11細(xì)胞后IL-1β和IL-8顯著上調(diào),其可能與ETT2及其效應(yīng)因子相關(guān)。研究結(jié)果表明,ETT2毒力島ATPase EivC參與APEC的運(yùn)動(dòng)性和致病性。
[Abstract]:Bacteria are transported to the extracellular or directly injected into the host cells through the secretory system, which is closely related to the survival and pathogenicity of the bacteria. The type III secretory system (Type III secretion system, T3SS) exists in pathogenic Escherichia coli, Salmonella and other bacteria, related to the secretion of virulence factors and pathogenicity. Researchers found EHEC O 157:H7 has a virulence Island similar to Salmonella SPI-1, named E.coli Type III secretion system 2 (ETT2). It was found that ETT2 virulence island was found in different pathogenic Escherichia coli. Although most of the ETT2 virulence island has genetic mutation and deletion, it plays an important role in adhesion invasion, intracellular survival, and biofilm formation. .APEC (Avian pathogenic E.coli, APEC) belongs to the intestinal pathogenic Escherichia coli (Extraintestinal Pathogenic E.coli, ExPEC), which can cause avian colibacillosis and cause huge economic loss to poultry industry. The study shows that APEC is similar to the human ExPEC genomic structure, and has many similar virulence factors and similar pathogenic mechanisms. APEC is the toxic gene storage of human ExPEC, which poses a potential threat to human health. In order to clarify the distribution and pathogenesis of ETT2 in APEC, this study conducted an epidemiological investigation on ETT2 in APEC, and analyzed the key active sites of ETT2 ATPase EivC and its effect on the pathogenicity of APEC, in order to further study the pathogenesis of ETT2 in APEC. Referring to the subtype and epidemiological investigation of.1.ETT2 in APEC in order to detect the distribution of ETT2 in APEC, this study was designed to detect the distribution of ETT2 in APEC clinical isolates by designing 8 overlapping PCR primers based on the ETT2 virulence Island sequence of EHEC O157:H7. Then, the ETT2 strip was sequenced and the ETT2 subtype was analyzed. The correlation between the ETT2 and the serotypes and the evolution groups was analyzed. The results showed that the 57.6% (141/245) APEC isolates contained ETT2 virulence island. The sequencing results showed that ETT2 in APEC was divided into complete ETT2 (named A subtype) and deletion mutant ETT2 (named B, C, D, and subtype). 2 and O78 serotype APEC. In addition, O78 serotype APEC only contains missing mutant ETT2, while intact ETT2 mainly exists in O1 and O2 serotype APEC. It is found that T3SS related gene clusters (EIP) exist only in the intact type ETT2 positive strains. 8) B2 evolution group APEC contains ETT2., however, the distribution of ETT2 virulence island and other virulence genes is not related. This study shows that the subtypes and distribution of ETT2 in APEC are significantly higher than those of human ExPEC. It is further proved that APEC has a potential threat to human health as a potential threat to.2.ETT2 virulence island component EivC clon expression and ATPase activity analysis in order to analyze APEC The ATPase activity of T2 virulence island component EivC and its key active site. This study designed the cloning and expression primers and point mutation primers for the analysis of the pathogenic bacteria ATPase sequence. Then the recombinant expression plasmid was constructed. The expression of the corresponding protein was purified after IPTG induction, and the ATPase viability was detected. The results showed that the EivC protein contained the conservatism of F0F1 ATPase. Sequence Walker Box A, Walker Box B and DCCD Box, so EivC may belong to the ATPase. enzyme activity test results, and His-EivC fusion protein has ATPase activity, phosphate release rate is 0.28 + according to the key site of pathogenic bacteria, select 175th lysine, 199th arginine, 201st arginine, 233rd. There is no significant difference between the point mutation and the ATPase activity of the wild type EivC. Therefore, this study shows that the EivC of ETT2 virulence island is ATPase, but the 175199201233rd bit amino acid does not affect the ATPase activity of the.3. avian pathogenic Escherichia coli APCE94 eivC gene deletion strain, and the construction and characteristics of the complementary strains are analyzed in order to distinguish them. The effects of ETT2 ATPase EivC on APEC phenotypes and virulence were analyzed. The eivC gene deletion strain of APCE94 was constructed using Red homologous recombination system and a eivC gene complementary strain was constructed with low copy plasmid pSTV28, and the growth characteristics, mobility, antisera bactericidal ability, adhesion / invasion ability, HD-1 of the wild strain and the complementary strain were compared and analyzed in the wild plant, HD-1. 1 cell memory live ability and animal pathogenicity difference. The expression level of APEC flagellum, pilus, virulence gene and HD-11 cell factor was detected by fluorescence quantitative method; and the morphological changes of bacterial surface were observed by transmission electron microscope. The results showed that the growth characteristics of eivC deletion plants were not significantly different from those of wild plants, but they were transported. The results showed that the flagellum on the surface of the eivC deletion strain decreased and the pilus increased, which resulted in the decrease of the bacterial motility. The fluorescence quantitative PCR results showed that the expression of flagellum and virulence genes decreased. In addition, the deletion of eivC led to its antiserum bactericidal ability and the memory living ability of HD-11 cells decreased significantly. Animal test results showed AP EC94 Delta eivC significantly decreased the virulence of ducks, in vivo survival and colonization. The fluorescence quantitative analysis of cell inflammatory factors found that IL-1 beta and IL-8 were significantly up-regulated after the deletion of APEC94 Delta eivC infected HD-11 cells, which may be related to ETT2 and its effect factors. The results showed that ETT2 poison island ATPase EivC participated in the motion and pathogenicity of APEC.

【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.61

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本文編號：1779008