本文選題：布氏桿菌 + 單克隆抗體��； 參考：《揚州大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：布氏桿菌病(Brucellaellosis)也稱布魯菌病(布病),是由布氏桿菌感染引起的一種最為常見的人獸共患傳染病之一,其中又以牛種和羊種布氏桿菌最為嚴重。布氏桿菌被列為必須報告病原體,除了少數(shù)已經(jīng)根除布病的國家,布病廣泛地分布于世界各地,我國也是布病流行極為嚴重的國家之一。最近幾年,布病在世界范圍內(nèi)呈反彈趨勢,給公共衛(wèi)生安全及畜牧業(yè)發(fā)展而帶來了巨大的經(jīng)濟損失,布病防控形勢十分嚴峻。由于目前尚未有理想的治療藥物,因此對布病的準確診斷是預(yù)防該病的關(guān)鍵。目前對布病的檢測方法主要是血清學(xué)方法,包括試管凝集試驗(SAT)、虎紅平板凝集試驗(RBPT)、補體結(jié)合試驗(CFT)、聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)和熒光偏振免疫分析法(FPIA)等。但是由于布氏桿菌的脂多糖(LPS)與另外一些革蘭陰性菌,特別是耶爾森菌09和大腸桿菌0157表面的LPS的結(jié)構(gòu)存在相似成分,因此在檢測中往往會發(fā)生交叉反應(yīng)而出現(xiàn)假陽性的檢測結(jié)果。鑒于此,本研究制備了具有特異性的抗牛種布氏桿菌的單克隆抗體,并且利用該單克隆抗體建立了檢測布氏桿菌抗體的競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(cELISA)方法,通過與商品化布病檢測試劑盒的比較,證明本研究的cELISA方法能夠有效地排除以耶爾森菌09和大腸桿菌0157為代表的典型革蘭氏陰性菌引起的假陽性的結(jié)果,在布病根除計劃中將具有重要應(yīng)用價值。1.抗布氏桿菌單克隆抗體的研制及特性鑒定本研究用滅活的牛種布氏桿菌S2308免疫BALB/c小鼠,按常規(guī)方法免疫三次后進行加強免疫,取小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合。將牛種布氏桿菌A99、耶爾森菌09和大腸桿菌0157分別包被酶標板,用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(iELISA)對雜交瘤細胞進行篩選,結(jié)果獲得2株穩(wěn)定分泌抗布氏桿菌抗體的雜交瘤細胞株Brucella-5C10和Brucella-4D2。對該2株雜交瘤進行特性分析,結(jié)果表明,Brucella-5C10腹水效價為1：64000,亞類鑒定為IgG3/X; Brucella-4D2腹水效價為1：32000,亞類鑒定為IgG3/λ。試管凝集試驗結(jié)果表明,2株單克隆抗體與牛種布氏桿菌S2308、牛種布氏桿菌A99、羊種布魯氏菌16M能發(fā)生較強凝集作用；而與耶爾森菌09、大腸桿菌0157無明顯凝集現(xiàn)象。免疫印跡法(Western-blot)結(jié)果顯示,該2株單克隆抗體與布氏桿菌菌體蛋白具有明顯反應(yīng)性,而與耶爾森菌09、大腸桿菌0157無明顯反應(yīng)。本研究所獲得的2株單克隆抗體為組建檢測動物血清中布氏桿菌抗體的cELISA試劑盒提供了優(yōu)良的生物材料。2.布氏桿菌抗體競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(cELISA)檢測試劑盒的研制為檢測待檢血清中布氏桿菌抗體,利用牛種布氏桿菌A99作為抗原包被酶標板,利用Brucella-5C10作為競爭抗體,HRP標記的羊抗鼠IgG作為第二抗體組建了cELISA試劑盒。優(yōu)化試驗結(jié)果表明,當牛種布氏桿菌A99按4μg/孔包被；單克隆抗體按1：4000稀釋；待檢血清按1：20稀釋；酶標二抗按1：10000作為工作濃度時本研究建立的cELISA方法檢測結(jié)果最適。通過ROC分析,本研究建立的cELISA方法確定抑制率30%作為臨界值,其敏感性(DSn)和特異性(DSp)在95%置信度(CI)下分別為93.3%和96.2%。用本研究建立的cELISA方法檢測臨床樣品320份牛血清和147份羊血清,并與商品化布病cELISA檢測方法作比較。結(jié)果表明,兩種cELISA方法共同檢測出牛血清樣品中167份陽性和139份陰性,出現(xiàn)了14份差異樣品,符合率為95.6%；共同檢測羊血清樣品112份陽性和24份陰性,出現(xiàn)了11份差異樣品,符合率為92.5%。進一步用CFT驗證其中的25份差異樣品,結(jié)果本研究建立的cELISA與CFT符合率為85%(21/25)。另外,利用該方法檢測牛羊種耶爾森菌09的高免血清,結(jié)果證明當高免血清的抗體濃度小于200 IU/ml時,本研究組建的cELISA試劑盒不會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。綜上所述,本研究建立的cELISA檢測試劑盒具有良好的特異性和靈敏度,能夠更好的排除由典型的交叉菌耶爾森菌09和大腸桿菌0157造成的假陽性現(xiàn)象,為布病的準確診斷提供了一種有效的血清學(xué)檢測工具。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S855.12

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本文編號：1762807