本文選題：NFκB1 + 乳合成　； 參考：《東北農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：乳是雌性哺乳動(dòng)物哺育其初生幼仔生長(zhǎng)和發(fā)育的天然營(yíng)養(yǎng)品,同時(shí)也是人類(lèi)生存必不可少的重要食品。乳合成的調(diào)控機(jī)理是生命科學(xué)的重要基礎(chǔ)問(wèn)題之一。探究乳合成相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,尋找調(diào)控乳合成的關(guān)鍵信號(hào)分子將會(huì)為奶牛乳產(chǎn)量和乳品質(zhì)的提高提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。營(yíng)養(yǎng)素和激素通過(guò)調(diào)控基因的表達(dá),在乳合成方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,特別是氨基酸在調(diào)控乳蛋白合成方面已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。目前,氨基酸和激素調(diào)控乳合成方面的研究已經(jīng)取得一定的成果,但對(duì)其調(diào)控乳合成分子機(jī)制的研究還不夠深入。因此,進(jìn)一步探究乳合成的分子調(diào)控機(jī)制,完善其分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是泌乳生物學(xué)領(lǐng)域的重要研究?jī)?nèi)容。核因子κB(nuclear factor ofκB,NFκB)作為真核細(xì)胞中重要的轉(zhuǎn)錄因子,廣泛參與多種基因的表達(dá)調(diào)控,在細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用,但在泌乳生物學(xué)領(lǐng)域的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。本課題以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)為研究基礎(chǔ),通過(guò)系統(tǒng)全面的研究,揭示了NFκB1通過(guò)PI3K信號(hào)途徑接受外源信號(hào)氨基酸(蛋氨酸)和激素(雌激素),正向調(diào)節(jié)下游靶基因m TOR、SREBP-1c、β4Gal-T2、Cyclin D1的表達(dá)。此外,本研究進(jìn)一步揭示甘氨酰t RNA合成酶(glycyl t RNA synthetase,Gly RS)能夠介導(dǎo)蛋氨酸(methionine,Met)和雌激素(estrogen,E)信號(hào),促進(jìn)NFκB1磷酸化進(jìn)而調(diào)控BMECs的乳合成和細(xì)胞增殖。本研究進(jìn)一步豐富和完善了乳合成的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò),為營(yíng)養(yǎng)素和激素調(diào)控乳合成的作用機(jī)理提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究使用的BMECs由組織塊培養(yǎng)法分離和純化獲得。用免疫熒光染色法檢測(cè)BMECs中角蛋白18(Cytokeratin 18)和β-酪蛋白(β-casein)的表達(dá)以鑒定細(xì)胞純度及泌乳能力。在培養(yǎng)液中添加Met(0.6 mmol/L)或E(2.72×10-2μg/L),q RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,NFκB1的表達(dá)量顯著上升,p-NFκB1水平顯著提高。免疫熒光結(jié)果顯示,Met和E還能夠促進(jìn)NFκB1入核及磷酸化。研究結(jié)果表明,NFκB1可能是介導(dǎo)Met和E促進(jìn)BMECs乳合成的重要調(diào)節(jié)因子。對(duì)NFκB1基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)和干擾。q RT-PCR和Western blot結(jié)果表明,NFκB1能夠正向調(diào)控與乳合成和細(xì)胞增殖相關(guān)的重要信號(hào)分子m TOR、SREBP-1c和Cyclin D1的表達(dá),以及提高β-casein和β4Gal-T2的表達(dá)水平。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示,NFκB1基因過(guò)表達(dá)能夠顯著促進(jìn)BMECs甘油三酯和乳糖的合成與分泌以及細(xì)胞增殖;而NFκB1基因干擾后,細(xì)胞合成與分泌甘油三酯和乳糖的水平及細(xì)胞增殖能力顯著降低。此外,對(duì)NFκB1基因過(guò)表達(dá)和干擾后BMECs中合成的脂滴進(jìn)行BODIPY染色,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,NFκB1能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂滴的合成,與上述結(jié)果一致。以上研究結(jié)果表明,NFκB1能夠正向調(diào)控BMECs的乳合成及細(xì)胞增殖。采用生物信息學(xué)手段,對(duì)mTOR、SREBP-1c、β4Gal-T2、Cyclin D1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000 bp的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)這些基因的啟動(dòng)子區(qū)域均可能含有NFκB1結(jié)合位點(diǎn)(κB序列)。染色質(zhì)免疫共沉淀(Ch IP)結(jié)果證實(shí)NFκB1與這些基因的啟動(dòng)子存在結(jié)合。Ch IP-q PCR結(jié)果顯示,添加Met和E后,NFκB1與靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合顯著升高。以上研究結(jié)果表明,Met和E能夠激活NFκB1并通過(guò)提高其與靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控乳合成和細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)。為了探究NFκB1接受Met和E信號(hào)的分子機(jī)制,實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了在添加PI3K抑制劑(wortmannin)和m TOR抑制劑(rapamycin)分別抑制PI3K和m TOR信號(hào)途徑后,NFκB1的表達(dá)與激活情況。結(jié)果顯示,抑制PI3K途徑后NFκB1和p-NFκB1的蛋白水平顯著下降,而抑制mTOR途徑后NFκB1和p-NFκB1的蛋白水平無(wú)顯著變化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在添加Met或E同時(shí)抑制PI3K途徑后,Met和E對(duì)NFκB1表達(dá)的促進(jìn)作用被明顯削弱。研究結(jié)果表明,Met和E通過(guò)PI3K途徑激活NFκB1。此外,對(duì)Gly RS介導(dǎo)Met和E信號(hào)促進(jìn)NFκB1磷酸化的分子機(jī)制進(jìn)行了研究。觀察過(guò)表達(dá)Gly RS及同時(shí)利用si RNA干擾NFκB1后,對(duì)下游靶基因mTOR、SREBP-1c和Cyclin D1表達(dá)的影響;以及觀察添加Met或E同時(shí)利用si RNA干擾Gly RS后,對(duì)NFκB1磷酸化的影響。研究結(jié)果表明,Gly RS介導(dǎo)了Met和E促進(jìn)NFκB1磷酸化的作用,以及Gly RS主要通過(guò)NFκB1調(diào)節(jié)mTOR、SREBP-1c和Cyclin D1信號(hào)通路。進(jìn)一步觀察利用si RNA干擾Gly RS同時(shí)干擾GCN2對(duì)NFκB1基因表達(dá)和磷酸化的影響。研究結(jié)果表明,Gly RS促進(jìn)NFκB1磷酸化的作用與GCN2途徑及NFκB1基因表達(dá)無(wú)關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室其它研究工作表明Gly RS直接結(jié)合和促進(jìn)NFκB1磷酸化,與本研究結(jié)果一致。綜上所述,NFκB1作為重要的轉(zhuǎn)錄因子能夠正向調(diào)控BMECs的乳合成和細(xì)胞增殖。Met和E通過(guò)PI3K途徑和Gly RS激活NFκB1。p-NFκB1通過(guò)與靶基因m TOR、SREBP-1c、β4Gal-T2和Cyclin D1啟動(dòng)子的結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控這些靶基因的表達(dá)。
[Abstract]:In this study , it is important to study the molecular mechanism of milk synthesis and to improve its molecular control network , which is an important research topic in the field of lactation biology . The results showed that NF - 魏B could promote the synthesis and secretion of BMECs and increase the expression of 尾 - casein and 尾 - 4Gal - T2 . The results showed that NF - 魏B could regulate the expression of NF - 魏B and the expression of 尾 - casein and 尾 - 4Gal - T2 . The effects of Gly RS on the phosphorylation of NF - 魏B were studied . The results showed that Gly - RS - mediated phosphorylation of NF - 魏B was not related to the expression of NF - 魏B and the expression of NF - 魏B in GCN2 pathway .

【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S823

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1751427