本文選題：RIG-I + 轉基因雞模型�。� 參考：《新疆農業(yè)大學》2015年碩士論文

【摘要】：維甲酸誘導基因I(retinoic acid inducible-gene I,RIG-I)是機體天然免疫系統(tǒng)中一類重要的模式識別受體,能夠識別病毒RNA,誘導Ⅰ型干擾素、細胞因子及趨化因子的產生,對機體抗病毒天然免疫的建立有重要作用。本實驗旨在建立表達RIG-I的轉基因雞模型,通過細胞水平的研究來揭示在表達RIG-I的F1代CEF細胞中是否重新建立了RIG-I信號通路,并具有抑制流感病毒活性的作用。本研究采用赤道開窗法,將符合注射標準滴度的重組慢病毒通過顯微注射針注射到受精蛋胚盤下腔,成功培育了轉入RIG-I基因的F0代轉基因雞;運用PCR、Southern blot、RT-PCR、Western blot分別在DNA、RNA、蛋白質水平對F0代雞進行鑒定分析;結果表明,15只F0代轉基因雞中6只有RIG-I基因的整合和表達;選取F0代表達RIG-I的轉基因公雞與同品種野生型母雞進行雜交繁育F1代,利用上述相同的方法對F1代轉基因雞進行鑒定分析;結果表明繁育的部分F1代轉基因雞中7只有外源基因的整合和表達,證明表達RIG-I的F0代轉基因雞攜帶的外源基因能夠遺傳至F1代。分離與培養(yǎng)F1代的CEF細胞,經分子生物學方法鑒定后,將其分為轉基因組(TG)、非轉基因組(NTG)和野生型組(WT)。用禽流感病毒感染CEF細胞,通過Western blot測定RIG-I蛋白的表達量,間接免疫熒光(IFA)和TCID50測定流感病毒的復制情況,熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測RIG-I及其下游IFN-β,抗病毒分子(PKR,OASL,MX1),促炎癥細胞因子(IRF7,IFIT5)以及流感模型基因(PB2)的mRNA水平。qRT-PCR和Western blot結果表明,TG組CEF細胞中感染組RIG-I的mRNA水平和RIG-I蛋白的表達量均高于未感染組;TG組與WT組相比,IFN-β上調2.4倍,其他細胞因子IRF7,IFIT5,PKR,OASL,MX1分別上調了2.1倍,1.5倍,1.9倍,2倍,1.9倍;IFA、TCID50與PB2基因拷貝數的結果表明TG組CEF細胞中流感病毒的增殖量均低于WT組。本研究獲得的F0代RIG-I轉基因雞體內有外源基因的整合與表達,其攜帶的外源基因能夠穩(wěn)定遺傳至F1代;證明了在表達RIG-I的F1代CEF細胞中重新建立了RIG-I信號通路,并具有抑制流感病毒的作用。為探索RIG-I基因在雞體內參與家禽天然免疫的機制及抑制流感病毒復制的作用奠定了基礎,并可為藥物開發(fā)等應用研究提供新的思路。
[Abstract]:In this study , the expression level , indirect immunofluorescence ( IFA ) and wild type group ( WT ) in F1 generation transgenic chickens were identified by Western blot . The results showed that the proliferation of influenza virus in CEF cells was lower than that in WT group .

【學位授予單位】：新疆農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

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