本文選題：RIG-I + 轉(zhuǎn)基因雞模型　； 參考：《新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：維甲酸誘導(dǎo)基因I(retinoic acid inducible-gene I,RIG-I)是機體天然免疫系統(tǒng)中一類重要的模式識別受體,能夠識別病毒RNA,誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素、細胞因子及趨化因子的產(chǎn)生,對機體抗病毒天然免疫的建立有重要作用。本實驗旨在建立表達RIG-I的轉(zhuǎn)基因雞模型,通過細胞水平的研究來揭示在表達RIG-I的F1代CEF細胞中是否重新建立了RIG-I信號通路,并具有抑制流感病毒活性的作用。本研究采用赤道開窗法,將符合注射標(biāo)準(zhǔn)滴度的重組慢病毒通過顯微注射針注射到受精蛋胚盤下腔,成功培育了轉(zhuǎn)入RIG-I基因的F0代轉(zhuǎn)基因雞;運用PCR、Southern blot、RT-PCR、Western blot分別在DNA、RNA、蛋白質(zhì)水平對F0代雞進行鑒定分析;結(jié)果表明,15只F0代轉(zhuǎn)基因雞中6只有RIG-I基因的整合和表達;選取F0代表達RIG-I的轉(zhuǎn)基因公雞與同品種野生型母雞進行雜交繁育F1代,利用上述相同的方法對F1代轉(zhuǎn)基因雞進行鑒定分析;結(jié)果表明繁育的部分F1代轉(zhuǎn)基因雞中7只有外源基因的整合和表達,證明表達RIG-I的F0代轉(zhuǎn)基因雞攜帶的外源基因能夠遺傳至F1代。分離與培養(yǎng)F1代的CEF細胞,經(jīng)分子生物學(xué)方法鑒定后,將其分為轉(zhuǎn)基因組(TG)、非轉(zhuǎn)基因組(NTG)和野生型組(WT)。用禽流感病毒感染CEF細胞,通過Western blot測定RIG-I蛋白的表達量,間接免疫熒光(IFA)和TCID50測定流感病毒的復(fù)制情況,熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測RIG-I及其下游IFN-β,抗病毒分子(PKR,OASL,MX1),促炎癥細胞因子(IRF7,IFIT5)以及流感模型基因(PB2)的mRNA水平。qRT-PCR和Western blot結(jié)果表明,TG組CEF細胞中感染組RIG-I的mRNA水平和RIG-I蛋白的表達量均高于未感染組;TG組與WT組相比,IFN-β上調(diào)2.4倍,其他細胞因子IRF7,IFIT5,PKR,OASL,MX1分別上調(diào)了2.1倍,1.5倍,1.9倍,2倍,1.9倍;IFA、TCID50與PB2基因拷貝數(shù)的結(jié)果表明TG組CEF細胞中流感病毒的增殖量均低于WT組。本研究獲得的F0代RIG-I轉(zhuǎn)基因雞體內(nèi)有外源基因的整合與表達,其攜帶的外源基因能夠穩(wěn)定遺傳至F1代;證明了在表達RIG-I的F1代CEF細胞中重新建立了RIG-I信號通路,并具有抑制流感病毒的作用。為探索RIG-I基因在雞體內(nèi)參與家禽天然免疫的機制及抑制流感病毒復(fù)制的作用奠定了基礎(chǔ),并可為藥物開發(fā)等應(yīng)用研究提供新的思路。
[Abstract]:In this study , the expression level , indirect immunofluorescence ( IFA ) and wild type group ( WT ) in F1 generation transgenic chickens were identified by Western blot . The results showed that the proliferation of influenza virus in CEF cells was lower than that in WT group .

【學(xué)位授予單位】：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

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本文編號：1749729