本文選題：JunB + SUnSET�。� 參考：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：骨骼肌是豬身體最大的組織,其重量約占總體重的40-50%。由于豬在出生時,肌纖維的數(shù)目已經(jīng)確定,因此豬出生后骨骼肌的生長主要取決于蛋白質(zhì)沉積的增加。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)合成大于蛋白質(zhì)降解時,骨骼肌表現(xiàn)為生長。研究表明,調(diào)控蛋白質(zhì)合成與降解的信號通路并不完全獨立,存在關(guān)鍵節(jié)點可以同時調(diào)控蛋白質(zhì)合成與降解,因此靶定節(jié)點可以明確調(diào)控靶點,更加有效地調(diào)控肌肉的凈沉積。研究表明轉(zhuǎn)錄因子Jun B作為節(jié)點可以促進(jìn)蛋白質(zhì)合成并抑制蛋白質(zhì)降解,其中抑制蛋白質(zhì)降解的機(jī)制已基本闡明,但是Jun B調(diào)控蛋白質(zhì)合成并不通過經(jīng)典的m TOR信號通路,具體的機(jī)制尚不清楚。m TOR信號通路作為調(diào)控蛋白質(zhì)合成的核心通路,主要是通過調(diào)控真核起始因子(eukaryotic initiaton factors,e IFs)發(fā)揮作用,因此,本試驗的目的是研究Jun B與蛋白質(zhì)翻譯起始和翻譯延長的關(guān)系,在細(xì)胞和分子水平闡明轉(zhuǎn)錄因子Jun B調(diào)控蛋白質(zhì)合成的機(jī)制。課題的研究內(nèi)容由兩部分組成,第一部分為建立試驗方法,將SUn SET非放射性方法發(fā)展為一個不僅可以檢測蛋白質(zhì)合成速率也能夠研究蛋白質(zhì)翻譯起始和延長的方法;第二部分為機(jī)制研究,運(yùn)用SUn SET方法檢測過表達(dá)和敲低Jun B后對蛋白質(zhì)合成速率的影響,及對翻譯起始、翻譯延長、核糖體生成的影響,以闡明轉(zhuǎn)錄因子Jun B調(diào)控蛋白質(zhì)合成的調(diào)控機(jī)理。第一部分內(nèi)容,運(yùn)用SUn SET非放射性方法研究蛋白質(zhì)翻譯及檢測蛋白質(zhì)合成速率。主要結(jié)果如下:1、確定用1μg/m L嘌呤霉素孵育C2C12肌管30min最佳。在0~5μg/m L的濃度范圍,隨著嘌呤霉素濃度的升高,相應(yīng)的含嘌呤霉素的蛋白質(zhì)增多,但是當(dāng)嘌呤霉素濃度達(dá)到10μg/m L時含嘌呤霉素的蛋白質(zhì)反而減少。2、SUn SET方法適用于檢測翻譯起始/翻譯延長變化所引起的蛋白質(zhì)合成速率的變化。用胰島素和雷帕霉素處理C2C12肌管細(xì)胞后分別促進(jìn)和減少了m TOR、S6K1蛋白磷酸化,表明翻譯起始發(fā)生變化,相應(yīng)SUn SET方法分別檢測到蛋白質(zhì)合成速率增加和減少;用羰基氰化氯苯腙(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone,CCCP)處理C2C12成肌細(xì)胞2min后,m TOR、S6K1、e IF2?蛋白磷酸化沒有發(fā)生變化,只有e EF2蛋白磷酸化增多,表明翻譯起始沒有發(fā)生變化而翻譯延長受到抑制,相應(yīng)SUn SET方法分別檢測到蛋白質(zhì)合成速率減少;用氨基酸饑餓和PBS饑餓處理C2C12成肌細(xì)胞后,m TOR、S6K1、e IF2?、e EF2蛋白磷酸化都發(fā)生變化,表明翻譯起始和翻譯延長都發(fā)生變化,相應(yīng)SUn SET方法檢測到蛋白質(zhì)合成速率變化一致。3、SUn SET方法適用于檢測C2C12成肌細(xì)胞、C3H10T1/2間充質(zhì)干細(xì)胞等不同特性的細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率。C3H10T1/2細(xì)胞分別進(jìn)行PBS饑餓、雷帕霉素處理、氨基酸饑餓、及氨基酸饑餓后加入氨基酸四種實驗處理后,運(yùn)用SUn SET方法檢測蛋白質(zhì)合成速率,結(jié)果與前面C2C12細(xì)胞中所得結(jié)果基本一致。第二部分內(nèi)容,轉(zhuǎn)錄因子Jun B調(diào)控C2C12成肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成機(jī)制的研究。主要結(jié)果如下:1、Jun B調(diào)控蛋白質(zhì)合成。C2C12成肌細(xì)胞過表達(dá)Jun B會促進(jìn)蛋白質(zhì)合成,敲低Jun B會抑制蛋白質(zhì)合成。2、Jun B不影響m TOR信號通路及e IF2?蛋白磷酸化,也不影響18S和28S核糖體r RNA生成,但是會影響e EF2蛋白磷酸化和e EF2激酶蛋白磷酸化,并影響myostatin-Smad信號通路。C2C12成肌細(xì)胞中過表達(dá)和敲低Jun B檢測m TOR、S6K1蛋白磷酸化沒有變化,e IF2?蛋白磷酸化也沒有變化,18S和28S核糖體r RNA生成也沒有變化,但是過表達(dá)Jun B檢測到翻譯延長關(guān)鍵蛋白e EF2蛋白的磷酸減少,e EF2上游激酶e EF2k(Ser359)磷酸化增多,敲低Jun B結(jié)果相反,變化情況與Jun B調(diào)控的蛋白合成變化情況一致。同樣過表達(dá)Jun B檢測到myostatin基因表達(dá)下調(diào),Smad蛋白磷酸化減少,敲低Jun B結(jié)果相反。綜上所述,本研究的結(jié)論是:1、驗證了SUn SET非放射性方法可以準(zhǔn)確檢測蛋白質(zhì)合成速率變化,并可用于研究蛋白質(zhì)翻譯起始和延長速率變化;2、myostatin-Smad信號通路通過抑制蛋白質(zhì)翻譯延長抑制蛋白質(zhì)合成;3、Jun B調(diào)控蛋白質(zhì)合成不依賴于m TOR信號通路,其作用機(jī)制:一方面通過調(diào)控e EF2激酶活性調(diào)控e EF2蛋白的的活性,調(diào)控翻譯延長;另一方面通過調(diào)控myostatin-Smad信號通路,調(diào)控蛋白質(zhì)合成速率。
[Abstract]:In this study , the mechanism of protein synthesis by Jun B was studied . The results showed that the mechanism of protein synthesis and protein synthesis was not completely independent . When C2C12 myoblasts were treated with carbonyl cyanide m - chlorophenylhydrazine ( CCCP ) for 2 min , the phosphorylation of m TOR , S6K1 , e IF2 ? protein did not change , but only the phosphorylation of e EF2 protein increased , indicating that translation initiation did not change and translation extension was inhibited , and the corresponding RSET method respectively detected the decrease of protein synthesis rate . After treatment of C2C12 myoblasts with amino acid starvation and PBS starvation , m TOR , S6K1 , e IF2 ? The results are as follows : 1 , Jun B does not influence the synthesis of protein synthesis . The results are as follows : 1 . Jun B does not influence the phosphorylation of protein synthesis . 2 . myostatin - Smad signaling pathway can inhibit protein synthesis by inhibiting protein translation ; 3 . Jun B control protein synthesis does not depend on the m TOR signal pathway , and the action mechanism of the myostatin - Smad signaling pathway is that the activity of the e EF2 protein is regulated by regulating the activity of e EF2 kinase , the translation is prolonged ; on the other hand , the synthesis rate of the protein is regulated by regulating the myostatin - Smad signaling pathway .

【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.2

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本文編號：1745696