本文選題：布魯氏菌 + TCS�。� 參考：《石河子大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：布魯氏菌(Brucella)和人蒼白桿菌(O.anthropi)親緣關(guān)系很親密,都屬于Proteobacteria類的α-2亞類。但是致病能力卻相差很大,布魯氏菌是一種可引起人獸共患的強(qiáng)致病菌,能夠?qū)θ澜绶秶鷥?nèi)的公共衛(wèi)生安全造成嚴(yán)重的危害;而人蒼白桿菌是一種條件性致病菌,對人類的危害較小。二元調(diào)控系統(tǒng)(Two-component systems,TCS)是廣泛存在于細(xì)菌中的一類重要的毒力調(diào)控系統(tǒng),可以通過感應(yīng)和處理環(huán)境信號來發(fā)揮其調(diào)控作用。該系統(tǒng)由組氨酸蛋白激酶(histidine protein kinase,HK)和反應(yīng)調(diào)控子(response-regulator protein,RR)組成。比較基因組學(xué)發(fā)現(xiàn),布魯氏菌和蒼白桿菌在基因組序列上差異較小,TCS是他們的主要差異之一。在蒼白桿菌中缺少布魯氏菌染色體II上的二元調(diào)控系統(tǒng)TceSR和TcfSR。先前研究表明位于染色體I上的12對TCS能夠調(diào)控布魯氏菌的能量代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)、生物大分子合成、細(xì)菌分裂以及細(xì)菌生存繁殖等與布魯氏菌毒力密切相關(guān)的基因,但位于染色體II上的的二元調(diào)控系統(tǒng)TceSR和TcfSR毒力表型和致病機(jī)制尚不清楚。本研究以突變株16M△TceSR和16M△TcfSR為研究對象,通過對其轉(zhuǎn)錄組測序和比較蛋白組研究的分析,揭示由二元調(diào)控系統(tǒng)TceSR和TcfSR調(diào)控的布魯氏菌的致病基因和致病性蛋白,為布魯氏菌的致病機(jī)制的研究和開發(fā)有效的治療藥物及疫苗奠定基礎(chǔ)。目的:本研究以羊種布魯氏菌親本株16M和突變株16M△TceSR和16M△TcfSR為研究對象,體外模擬巨噬細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境,找出TCS TceSR和TcfSR體外高效表達(dá)的條件,在此條件下培養(yǎng)親本株株16M和突變株16M△TceSR和16M△TcfSR,通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和比較蛋白組學(xué)研究深入探討TCS TceSR和TcfSR在布魯氏菌中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其與布魯氏菌致病性的關(guān)系,以期解釋TCS TceSR和TcfSR感受和處理環(huán)境信號后如何調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄和靶蛋白的表達(dá),從而促進(jìn)布魯氏菌的生存。通過本實(shí)驗(yàn)的研究為布魯氏菌的致病機(jī)制提供重要的信息。方法:(1)體外模擬細(xì)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境,先將親本株16M在TSB中培養(yǎng)至對數(shù)生長期,收菌重懸于高鹽、低p H、高溫、營養(yǎng)缺乏等環(huán)境壓力下刺激0.5h,收菌提RNA,反轉(zhuǎn)錄成c DNA。針對Tce S、Tce R、Tcf S、Tcf R四個(gè)基因設(shè)計(jì)引物利用q RT-PCR技術(shù)確定最佳刺激條件。確定了最佳的刺激條件以后,將細(xì)菌在該條件下刺激不同的時(shí)間(0.5h、l.5h、3h、4.5h、6h),提取細(xì)菌RNA,反轉(zhuǎn)錄成c DNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測,確定最佳刺激時(shí)間。(2)在體外表達(dá)最佳條件中培養(yǎng)親本株16M和突變株16M△TceSR和16M△TcfSR,制備全菌樣品樣品。采用Label-free技術(shù),并結(jié)合生物信息學(xué)分析,篩選出在缺失株和親本株中差異表達(dá)的蛋白,以期揭示TCS TceSR和TcfSR在布魯氏菌中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與致病性的關(guān)系。(3)在體外表達(dá)最佳環(huán)境中培養(yǎng)親本株16M和缺失株16M△TceSR和16M△TcfSR,培養(yǎng)至最佳時(shí)間點(diǎn)時(shí),收集菌體,提取RNA,采用RNA-seq技術(shù),并結(jié)合生物信息學(xué)分析,篩選出在突變株和親本株中差異表達(dá)的基因,以期揭示TCS TceSR和TcfSR在布魯氏菌中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與致病性的關(guān)系。結(jié)果:(1)通過體外模擬巨噬細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境,利用q RT-PCR方法確定了細(xì)胞在營養(yǎng)缺乏、p H值為4的情況下刺激3h時(shí),Tce S、Tce R、Tcf S、Tcf R四個(gè)基因的表達(dá)量均是最高。因此將體外高效表達(dá)的條件確定為GEM4.0中刺激3h。(2)比較蛋白質(zhì)組結(jié)果顯示:在親本株16M和突變株16M△TceSR中共有465個(gè)蛋白的表達(dá)發(fā)生了變化,差異表達(dá)倍數(shù)在2以上的有257個(gè)。在突變株16M△TceSR差異表達(dá)倍數(shù)在兩倍以上的下調(diào)蛋白共有147個(gè),上調(diào)蛋白共110個(gè)。這些發(fā)生表達(dá)變化的蛋白主要是與碳氮代謝、二元調(diào)控系統(tǒng)、細(xì)胞分裂、熱休克蛋白、外膜蛋白、氧化磷酸化、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子和轉(zhuǎn)錄相關(guān)的蛋白。在親本株16M和16M△TcfSR中共有137個(gè)蛋白的表達(dá)發(fā)生變化,在這些差異表達(dá)的蛋白中我們選取差異表達(dá)倍數(shù)兩倍以上的作為差異表達(dá)蛋白的研究對象,共86個(gè),其中在突變株16M△TcfSR中表達(dá)上調(diào)的有44個(gè),表達(dá)下調(diào)的有42個(gè)。這些差異表達(dá)的蛋白主要與布魯氏菌的代謝、氧化磷酸化、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、IV型分泌系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)運(yùn)輸和RNA降解相關(guān)。(3)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示:在16M和16M△TceSR中的每個(gè)菌株中共檢測了3121個(gè)基因,與16M相比,在16M△TceSR中共有331個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生了顯著的變化,其中有137個(gè)基因在突變株中顯著的下降,194個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生了上調(diào)(p0.05)。在這些差異表達(dá)的基因主要涉及二元調(diào)控系統(tǒng),碳氮代謝、氧化磷酸化、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、核糖體合成相關(guān)基因、脂多糖和分泌系統(tǒng)等。在16M和16M△TcfSR中的每個(gè)菌株中共檢測了3117個(gè)基因,與16M相比,在16M△TcfSR中共有342個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生了顯著的變化,其中有177個(gè)基因在突變株中顯著的下降,165個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生了上調(diào)(p0.05)。在這些差異表達(dá)的基因主要涉及核糖體大小亞基組成相關(guān)的基因、碳代謝、氧化磷酸化、細(xì)菌分泌系統(tǒng)、脂肪酸合成、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、氨基酸代謝、嘌呤、嘧啶代謝和DNA復(fù)制、修復(fù)以及RNA降解、TCS等。結(jié)論:(1)TCS TceSR和TcfSR體外高效表達(dá)的條件均為GEM4.0中刺激3h;(2)全菌蛋白label-free技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明兩個(gè)缺失株和親本株相比,都有很多蛋白和基因的表達(dá)都發(fā)生了變化,說明TCS TceSR和TcfSR在布魯氏菌內(nèi)均有有一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),從而使布魯氏菌適應(yīng)各種復(fù)雜的環(huán)境。通過本課題的研究,對TCS TceSR和TcfSR在布魯氏菌胞內(nèi)生存中和其調(diào)控的的分子機(jī)制有一個(gè)初步的了解,為深入研究TCS TceSR和TcfSR與布魯氏菌胞的生存和致病性提供了重要線索。
[Abstract]:Two - component systems ( TceSR ) and 16M 鈻，

本文編號：1745538