本文選題：GTPV + 實(shí)時(shí)熒光定量PCR�。� 參考：《揚(yáng)州大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：山羊痘病毒(Goatpox virus,GTPV)為急性接觸性傳染病,可感染各種年齡、性別和品種的山羊,造成山羊發(fā)熱、皮膚丘疹和黏膜臟器廣泛性的痘疹等臨床癥狀,導(dǎo)致生產(chǎn)能力下降,嚴(yán)重威脅國內(nèi)外養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。目前我國防控該病的主要措施是疫苗免疫的方法,但仍時(shí)有疫情發(fā)生,因此,建立快速診斷該病方法是十分必要的。本研究將在原代胎羊睪丸細(xì)胞分離的GTPV-XZ株在Vero細(xì)胞進(jìn)行傳代,同時(shí)克隆表達(dá)GTPVP32蛋白,免疫小鼠制備單抗,為建立快速,操作簡便、成本低廉的檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。1.GTPV Vero細(xì)胞適應(yīng)毒的培育將分離的山羊痘病毒轉(zhuǎn)接到Vero細(xì)胞上進(jìn)行連續(xù)傳代,通過20代的傳代培養(yǎng),細(xì)胞的CPE趨于穩(wěn)定,接毒3d后,細(xì)胞皺縮拉網(wǎng),形成許多聚集的細(xì)胞團(tuán)塊,5d后細(xì)胞開始脫落,在病變達(dá)到80%的時(shí)候進(jìn)行收獲,繼續(xù)傳代。選取每一代病毒測(cè)定TCID50,同時(shí)繪制了 GTPVP32基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線,使用qRT-PCR對(duì)每代病毒進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示前期病毒在Vero細(xì)胞上的增殖含量較低,通過連續(xù)20代培養(yǎng)之后GTPV的增殖滴度小幅提高并趨于穩(wěn)定,因此獲得了 Vero細(xì)胞適應(yīng)毒。2.GTPV P32基因的原核表達(dá)通過克隆P32基因,并將其插入pET-32a表達(dá)載體上,轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21后用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示,在37℃、220rpm、1M IPTG條件下,融合蛋白P32-His能以可溶性形式大量表達(dá)。經(jīng)His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化后,獲得可溶性的重組蛋白濃度為2.5 mg/mL。使用純化的P32蛋白免疫BALB/c小鼠制備多抗血清,通過IFA試驗(yàn)結(jié)果顯示:制備多抗血清能與感染GTPV的Vero細(xì)胞產(chǎn)生特異性的熒光,表明重組的P32蛋白有較好的免疫原性,為下一步進(jìn)行P32蛋白單克隆抗體的制備提供材料。3.抗GTPVP32蛋白單克隆抗體的制備使用純化的P32-His融合蛋白免疫六周齡BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0進(jìn)行融合,通過間接ELISA和IFA的方法篩選,獲得2株能穩(wěn)定分泌抗P32蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株,命名為2B4和2E10。IFA結(jié)果顯示,這兩株單抗均能與感染GTPV的Vero細(xì)胞反應(yīng)產(chǎn)生特異性熒光;Western-blot試驗(yàn)結(jié)果則顯示,2B4和2E10能與病毒蛋白反應(yīng);這兩株單抗與實(shí)驗(yàn)室分離保存的2株ORFV均不反應(yīng)。因此,基于這兩株單抗可建立快速敏感的抗原檢測(cè)方法。
[Abstract]:The results showed that the recombinant P32 - His fusion protein could be used to prepare polyclonal antibody against GTPV . The results showed that the recombinant P32 protein could be used to prepare polyclonal antibody against GTPV . The spleen cells of immunized mice were fused with SP2 / 0 . Two hybridoma cell lines secreting anti - P32 protein antibodies were screened by indirect ELISA and IFA . The results showed that both monoclonal antibodies could react with Vero cells infected with GTPV . The results of Western - blot showed that both monoclonal antibodies and 2E10 could react with viral proteins .

【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.654

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳伯祥;楊明;賀l陸，

本文編號(hào)：1740570