本文選題：豬繁殖與呼吸綜合征病毒 + 病毒受體��； 參考：《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),俗稱(chēng)“豬藍(lán)耳病”,是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種高度接觸性傳染病,該病以妊娠母豬流產(chǎn)、返情、產(chǎn)死胎或弱仔、仔豬死亡及各種年齡的豬不同程度的呼吸道癥狀為主要特征,并且能破壞豬的免疫系統(tǒng),引起混合感染或繼發(fā)感染,給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了極為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失�，F(xiàn)階段使用疫苗免疫仍是防制PRRS流行的主要手段。病毒的體外分離和鑒定是研究和防治PRRS的基礎(chǔ)和前提,而PRRSV表現(xiàn)出相當(dāng)嚴(yán)格的細(xì)胞嗜性,在體外培養(yǎng)時(shí)僅能感染豬肺泡巨噬細(xì)胞、豬脾巨噬細(xì)胞和源于MA-104的幾個(gè)亞細(xì)胞系(MARC-145、CL2621、HS.2H)。由于最容易感染PRRSV的巨噬細(xì)胞難于獲得且只能原代培養(yǎng),操作成本高昂,而且目前常用的MARC-145細(xì)胞雖然可以增殖PRRSV,但是存在著PRRSV增殖速度慢、滴度低的局限性,因此建立一種能夠快速、高效地增殖PRRSV的細(xì)胞系成為當(dāng)務(wù)之急。PRRS侵染宿主細(xì)胞的第一步是與細(xì)胞上的受體結(jié)合,研究表明CD163作為PRRSV的受體介導(dǎo)病毒的脫衣殼和病毒核酸在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的釋放,與PRRSV的感染密切相關(guān),并且Patton等人的研究結(jié)果表明PRRSV的感染能力與CD163受體的表達(dá)水平具有直接的相關(guān)性。因此,本研究旨在構(gòu)建一株能夠穩(wěn)定、高效表達(dá)CD163的MARC-145細(xì)胞系,從而能夠高效、快速地增殖PRRSV,為PRRSV的相關(guān)研究和疫苗開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。本研究根據(jù)GenBank中收錄的相關(guān)序列設(shè)計(jì)引物從PAM(豬肺泡巨噬細(xì)胞)中擴(kuò)增pCD163基因,將其插入真核表達(dá)載體pCI-neo構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-pCD163,將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞,通過(guò)G418篩選、單克隆化并擴(kuò)大培養(yǎng)篩選獲得表達(dá)豬CD163的MARC-145細(xì)胞系,命名為pCD163-MARC。間接免疫熒光(IFA)結(jié)果顯示,構(gòu)建的pCD163-MARC細(xì)胞系中熒光強(qiáng)度明顯高于普通MARC-145細(xì)胞;Western blot結(jié)果顯示pCD163-MARC細(xì)胞系中pCD163蛋白表達(dá)量約為對(duì)照MARC-145細(xì)胞中pCD163蛋白表達(dá)量的8.7倍。且該細(xì)胞系可穩(wěn)定傳至20代,各代次之間pCD163蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異。將pCD163-MARC細(xì)胞與MARC-145細(xì)胞同時(shí)感染1MOI的PRRSV經(jīng)典株SD-1株和高致病性毒株SD-JN株,測(cè)定pCD163-MARC和MARC-145細(xì)胞增殖PRRSV的生長(zhǎng)曲線(xiàn)實(shí)驗(yàn)表明pCD163-MARC細(xì)胞增殖兩株病毒的滴度有了明顯提高。RT-PCR實(shí)驗(yàn)亦表明pCD163-MARC細(xì)胞增殖的PRRSV的RNA量明顯高于MARC-145細(xì)胞。在該細(xì)胞系的應(yīng)用方面,我們將本實(shí)驗(yàn)室2012.06-2014.06期間RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性的PRRSV病料樣品120份同時(shí)接種pCD163-MARC細(xì)胞與MARC-145細(xì)胞,盲傳5代后兩者對(duì)PRRSV的分離率分別為100%和80%,pCD163-MARC細(xì)胞顯然具有更高的PRRSV分離率,更適合于臨床PRRSV的分離培養(yǎng)。我們將pCD163-MARC細(xì)胞與MARC-145細(xì)胞擴(kuò)大至轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng),同時(shí)感染1MOI的廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司生產(chǎn)的PRRS疫苗JXA1-R株,96 h收毒,結(jié)果顯示病毒在pCD163-MARC細(xì)胞上的滴度為1×108.5TCID50/mL,在MARC-145細(xì)胞上的滴度為1×107.6TCID50/mL。說(shuō)明pCD163-MARC細(xì)胞比MARC-145細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖PRRS疫苗JXA1-R株的能力,可以初步應(yīng)用于PRRS疫苗毒的生產(chǎn)。
[Abstract]:Porcine reproductive and respiratory syndrome ( PRRS ) , commonly known as " porcine reproductive and respiratory syndrome ( PRRS ) , is a highly contagious disease caused by porcine reproductive and respiratory syndrome virus ( PRRS ) . The expression level of pCD163 - MARC was significantly higher than that of normal MARC - 145 cells . The results showed that the expression of pCD163 - MARC was significantly higher than that of normal MARC - 145 cells .

【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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1 寧宜寶;鄭杰;張純萍;宋立;劉惠文;王琴;丘惠深;丘伯根;趙啟祖;沈青春;劉業(yè)兵;范學(xué)政;徐璐;江煥賢;;我國(guó)南方豬高熱病的研究(Ⅰ)——大腸桿菌的分離、鑒定和致病性測(cè)定[J];中國(guó)獸藥雜志;2006年12期

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本文編號(hào)：1738148