大熊貓犬瘟熱流行病學調(diào)查與實驗免疫研究
本文選題:犬瘟熱病毒 + 大熊貓; 參考:《吉林農(nóng)業(yè)大學》2017年博士論文
【摘要】:犬瘟熱(Canine distemper,CD)是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)感染引起的犬和其他肉食動物的一種急性、高度接觸性傳染病。近年來CDV的宿主范圍不斷擴大,已由傳統(tǒng)的犬科、浣熊科和鼬科擴展到貓科、靈貓科等所有陸地食肉目動物及非人靈長類動物。近年來大熊貓種群的增加和棲息地的不斷擴大使得大熊貓感染疾病的風險大大增加,犬瘟熱已成為威脅大熊貓種群數(shù)量和生命安全的第一大傳染病。2014年12月-2015年4月,陜西省珍稀野生動物搶救飼養(yǎng)研究中心暴發(fā)圈養(yǎng)大熊貓犬瘟熱疫情,共造成5只大熊貓死亡。本研究通過病原分離和抗體檢測,首次證明CDV已經(jīng)具備對大熊貓的跨種感染能力。疫苗免疫是預(yù)防CDV感染唯一的有效措施,但因現(xiàn)有弱毒疫苗對大熊貓具有致病性,目前尚無安全性高、穩(wěn)定而有效的大熊貓用犬瘟熱疫苗。本研究結(jié)合已有數(shù)據(jù),針對大熊貓宿主的珍稀性和敏感性,開展了全病毒滅活疫苗和病毒樣顆粒亞單位疫苗的制備與免疫原性評估。鑒于雪貂用CDV重組金絲雀痘病毒活載體疫苗的安全性和有效性已經(jīng)在2只大熊貓上通過免疫試驗得到證實,本研究對商品化犬用金絲雀痘病毒重組犬瘟熱活載體疫苗在大熊貓上進行了免疫效果評價。第一章:大熊貓犬瘟熱病毒分離鑒定及遺傳進化分析。通過對2014年12月-2015年4月陜西省珍稀野生動物搶救飼養(yǎng)研究中心送檢大熊貓樣品的RT-PCR檢測,發(fā)現(xiàn)22只大熊貓中共有6只CDV核酸檢測陽性,其中5只后期表現(xiàn)全身抽搐的嚴重神經(jīng)癥狀,搶救無效相繼死亡。處于同一(龍龍、鳳鳳)或相鄰圈舍(大寶、欣欣)的4只大熊貓相繼發(fā)病死亡,表明直接接觸或飛沫可能是其在大熊貓間相互傳播的原因。將死亡大熊貓組織接種Vero/DogSLAM細胞系進行病毒分離培養(yǎng),經(jīng)電鏡觀察、細胞病變及CDV特異性抗體染色以及基因組序列測定等一系列分析確定所分離病毒為CDV,命名為giant panda/SX/2014。H基因遺傳進化和氨基酸差異分析結(jié)果顯示,giant panda/SX/2014仍屬于流行的Asia-1型,但H蛋白出現(xiàn)了5個氨基酸突變:V26M、T213A、K281R、S300N和P340Q。此外,還發(fā)現(xiàn)決定與宿主SLAM受體結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點549位aa突變?yōu)镠is(H),而非犬源分離株Tyr(Y)。推測giant panda/SX/2014 H蛋白Y549H替換可能導致CDV獲得了跨種傳播能力,且毒力增強,從而引發(fā)了此次大熊貓CDV的致死性感染。大熊貓“珠珠”CDV核酸檢測陽性,但因體內(nèi)存在CDV中和抗體(效價為1:128),未表現(xiàn)臨床癥狀,至今仍存活,表明中和抗體可以使大熊貓免受CDV強毒的致死性攻擊。提示可通過疫苗免疫接種預(yù)防大熊貓犬瘟熱。第二章:犬瘟熱滅活疫苗制備與免疫原性評估研究。由于CDV弱毒疫苗株可能會引起一些易感野生動物感染與發(fā)病,大熊貓也曾有因接種CDV弱毒疫苗發(fā)病死亡的報道。為此,本研究進行了犬瘟熱滅活疫苗的制備。為保證疫苗免疫原劑量,本研究以荷蘭Applikon細胞培養(yǎng)罐和GE公司Cytodexl球型微載體生產(chǎn)CDV,最高滴度可達107.8TCID50/mL。共選擇β-丙內(nèi)酯、甲醛2種滅活劑和3種不同的免疫劑量組合評估了犬瘟熱滅活疫苗小鼠的免疫效果,結(jié)果顯示甲醛滅活疫苗組免疫效果優(yōu)于β-丙內(nèi)酯滅活疫苗組,且免疫效果與劑量呈正相關(guān),原液免疫組血清的中和抗體效價明顯高于5×稀釋組和10×稀釋組,10×稀釋組也可以誘導小鼠產(chǎn)生持久的中和抗體。為了進一步評價滅活疫苗的免疫原性,分別將其免疫水貂和狐貍,結(jié)果顯示CDV甲醛滅活疫苗均可以誘導水貂和狐貍產(chǎn)生特異性中和抗體,顯示出良好的免疫原性。在整個免疫試驗中,未見任何免疫動物表現(xiàn)出犬瘟熱的臨床癥狀,結(jié)果表明:制備的犬瘟熱滅活疫苗安全且具有良好的免疫原性。但其是否可以應(yīng)用于大熊貓CDV預(yù)防,成為安全、有效的疫苗候選者還需進一步證實。第三章:犬瘟熱病毒病毒樣顆粒構(gòu)建與實驗免疫研究。VLPs是由某種病毒的一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白自行裝配而成的空心蛋白顆粒,可以誘導體液和細胞免疫,作為疫苗具有獨特的優(yōu)勢。M蛋白是副黏病毒VLPs形成和出芽的主要驅(qū)動力,H蛋白是機體的主要保護性抗原,為此,本研究克隆giant panda/SX/2014 M和H基因,通過flashBAC桿狀病毒表達系統(tǒng)分別拯救表達CDV M和H蛋白的重組桿狀病毒,共感染昆蟲細胞Sf9,即可自主裝配成CDV VLPs并分泌到培養(yǎng)上清。電鏡觀察CDV VLPs大小約100nm左右,表面有纖突結(jié)構(gòu),呈典型的副黏病毒特征。Western Blot結(jié)果證實所構(gòu)建CDV VLPs確由M與H蛋白組成。為初步評價CDV VLPs免疫原性,將包含CDV VLPs培養(yǎng)上清與佐劑混合后分別免疫水貂和狐貍,結(jié)果顯示:CDV VLPs經(jīng)兩次免疫仍不能誘發(fā)水貂和狐貍產(chǎn)生可檢測VNAs反應(yīng),可能需多次免疫或?qū)LPs純化才能獲得理想的免疫效果。第四章:犬用金絲雀痘病毒重組犬瘟熱疫苗大熊貓實驗免疫研究。金絲雀痘病毒重組活載體是一種非復(fù)制型載體,接種哺乳動物后外源基因可進行轉(zhuǎn)錄表達而不能形成感染性子代病毒,是一種安全有效的病毒載體。目前,梅里亞公司已成功研發(fā)多種表達CDV弱毒疫苗株F和H基因的重組金絲雀痘病毒活載體疫苗。本研究選擇商品化犬用金絲雀痘病毒重組犬瘟熱活載體疫苗“Recombitek?CDV”,分別按兩種不同的免疫策略對來自某研究中心的23只大熊貓和某研究基地的37只大熊貓進行實驗免疫,通過檢測免疫動物的血清抗體效價評估該疫苗的免疫效果。結(jié)果顯示:犬用重組犬瘟熱疫苗可以誘導大熊貓產(chǎn)生中和抗體。經(jīng)過兩次疫苗免疫后,某研究中心的23只大熊貓無論有無預(yù)存抗體均全部能檢測到CDV VNAs,平均值分別為65.1、33.1,范圍為8-256;某研究基地的37只大熊貓中有9只可以檢測到CDV VNAs,效價范圍為8-32。進一步依據(jù)抗體陽性率和中和抗體水平高低確定最佳免疫策略為:初次免疫對有初始抗體的大熊貓接種1頭份/只,無初始抗體的大熊貓接種2頭份/只,3周后加強免疫一次,劑量為1頭份/只。
[Abstract]:In recent years , there have been a significant increase in the number of giant panda population and the genetic evolution of wild giant panda . In the last few years , we have found that CDV is the only effective measure to prevent the infection of giant panda . In order to evaluate the immunogenicity of inactivated vaccine , the results showed that the vaccine could induce specific neutralizing antibody against CDV vaccine . The results showed that the vaccine could induce humoral and cellular immunity , and it could induce humoral and cellular immunity . In this study , 23 giant pandas from a research center and 37 giant pandas from a research base were immunized by two different immune strategies .
【學位授予單位】:吉林農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】:博士
【學位授予年份】:2017
【分類號】:S858.93
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本文編號:1737064
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