發(fā)布時(shí)間：2018-04-11 17:58

  本文選題：犬瘟熱病毒 + 大熊貓�。� 參考：《吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：犬瘟熱(Canine distemper,CD)是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)感染引起的犬和其他肉食動(dòng)物的一種急性、高度接觸性傳染病。近年來(lái)CDV的宿主范圍不斷擴(kuò)大,已由傳統(tǒng)的犬科、浣熊科和鼬科擴(kuò)展到貓科、靈貓科等所有陸地食肉目動(dòng)物及非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物。近年來(lái)大熊貓種群的增加和棲息地的不斷擴(kuò)大使得大熊貓感染疾病的風(fēng)險(xiǎn)大大增加,犬瘟熱已成為威脅大熊貓種群數(shù)量和生命安全的第一大傳染病。2014年12月-2015年4月,陜西省珍稀野生動(dòng)物搶救飼養(yǎng)研究中心暴發(fā)圈養(yǎng)大熊貓犬瘟熱疫情,共造成5只大熊貓死亡。本研究通過(guò)病原分離和抗體檢測(cè),首次證明CDV已經(jīng)具備對(duì)大熊貓的跨種感染能力。疫苗免疫是預(yù)防CDV感染唯一的有效措施,但因現(xiàn)有弱毒疫苗對(duì)大熊貓具有致病性,目前尚無(wú)安全性高、穩(wěn)定而有效的大熊貓用犬瘟熱疫苗。本研究結(jié)合已有數(shù)據(jù),針對(duì)大熊貓宿主的珍稀性和敏感性,開(kāi)展了全病毒滅活疫苗和病毒樣顆粒亞單位疫苗的制備與免疫原性評(píng)估。鑒于雪貂用CDV重組金絲雀痘病毒活載體疫苗的安全性和有效性已經(jīng)在2只大熊貓上通過(guò)免疫試驗(yàn)得到證實(shí),本研究對(duì)商品化犬用金絲雀痘病毒重組犬瘟熱活載體疫苗在大熊貓上進(jìn)行了免疫效果評(píng)價(jià)。第一章:大熊貓犬瘟熱病毒分離鑒定及遺傳進(jìn)化分析。通過(guò)對(duì)2014年12月-2015年4月陜西省珍稀野生動(dòng)物搶救飼養(yǎng)研究中心送檢大熊貓樣品的RT-PCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)22只大熊貓中共有6只CDV核酸檢測(cè)陽(yáng)性,其中5只后期表現(xiàn)全身抽搐的嚴(yán)重神經(jīng)癥狀,搶救無(wú)效相繼死亡。處于同一(龍龍、鳳鳳)或相鄰圈舍(大寶、欣欣)的4只大熊貓相繼發(fā)病死亡,表明直接接觸或飛沫可能是其在大熊貓間相互傳播的原因。將死亡大熊貓組織接種Vero/DogSLAM細(xì)胞系進(jìn)行病毒分離培養(yǎng),經(jīng)電鏡觀察、細(xì)胞病變及CDV特異性抗體染色以及基因組序列測(cè)定等一系列分析確定所分離病毒為CDV,命名為giant panda/SX/2014。H基因遺傳進(jìn)化和氨基酸差異分析結(jié)果顯示,giant panda/SX/2014仍屬于流行的Asia-1型,但H蛋白出現(xiàn)了5個(gè)氨基酸突變:V26M、T213A、K281R、S300N和P340Q。此外,還發(fā)現(xiàn)決定與宿主SLAM受體結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)549位aa突變?yōu)镠is(H),而非犬源分離株Tyr(Y)。推測(cè)giant panda/SX/2014 H蛋白Y549H替換可能導(dǎo)致CDV獲得了跨種傳播能力,且毒力增強(qiáng),從而引發(fā)了此次大熊貓CDV的致死性感染。大熊貓“珠珠”CDV核酸檢測(cè)陽(yáng)性,但因體內(nèi)存在CDV中和抗體(效價(jià)為1:128),未表現(xiàn)臨床癥狀,至今仍存活,表明中和抗體可以使大熊貓免受CDV強(qiáng)毒的致死性攻擊。提示可通過(guò)疫苗免疫接種預(yù)防大熊貓犬瘟熱。第二章:犬瘟熱滅活疫苗制備與免疫原性評(píng)估研究。由于CDV弱毒疫苗株可能會(huì)引起一些易感野生動(dòng)物感染與發(fā)病,大熊貓也曾有因接種CDV弱毒疫苗發(fā)病死亡的報(bào)道。為此,本研究進(jìn)行了犬瘟熱滅活疫苗的制備。為保證疫苗免疫原劑量,本研究以荷蘭Applikon細(xì)胞培養(yǎng)罐和GE公司Cytodexl球型微載體生產(chǎn)CDV,最高滴度可達(dá)107.8TCID50/mL。共選擇β-丙內(nèi)酯、甲醛2種滅活劑和3種不同的免疫劑量組合評(píng)估了犬瘟熱滅活疫苗小鼠的免疫效果,結(jié)果顯示甲醛滅活疫苗組免疫效果優(yōu)于β-丙內(nèi)酯滅活疫苗組,且免疫效果與劑量呈正相關(guān),原液免疫組血清的中和抗體效價(jià)明顯高于5×稀釋組和10×稀釋組,10×稀釋組也可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生持久的中和抗體。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)滅活疫苗的免疫原性,分別將其免疫水貂和狐貍,結(jié)果顯示CDV甲醛滅活疫苗均可以誘導(dǎo)水貂和狐貍產(chǎn)生特異性中和抗體,顯示出良好的免疫原性。在整個(gè)免疫試驗(yàn)中,未見(jiàn)任何免疫動(dòng)物表現(xiàn)出犬瘟熱的臨床癥狀,結(jié)果表明:制備的犬瘟熱滅活疫苗安全且具有良好的免疫原性。但其是否可以應(yīng)用于大熊貓CDV預(yù)防,成為安全、有效的疫苗候選者還需進(jìn)一步證實(shí)。第三章:犬瘟熱病毒病毒樣顆粒構(gòu)建與實(shí)驗(yàn)免疫研究。VLPs是由某種病毒的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白自行裝配而成的空心蛋白顆粒,可以誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫,作為疫苗具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。M蛋白是副黏病毒VLPs形成和出芽的主要驅(qū)動(dòng)力,H蛋白是機(jī)體的主要保護(hù)性抗原,為此,本研究克隆giant panda/SX/2014 M和H基因,通過(guò)flashBAC桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)分別拯救表達(dá)CDV M和H蛋白的重組桿狀病毒,共感染昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9,即可自主裝配成CDV VLPs并分泌到培養(yǎng)上清。電鏡觀察CDV VLPs大小約100nm左右,表面有纖突結(jié)構(gòu),呈典型的副黏病毒特征。Western Blot結(jié)果證實(shí)所構(gòu)建CDV VLPs確由M與H蛋白組成。為初步評(píng)價(jià)CDV VLPs免疫原性,將包含CDV VLPs培養(yǎng)上清與佐劑混合后分別免疫水貂和狐貍,結(jié)果顯示:CDV VLPs經(jīng)兩次免疫仍不能誘發(fā)水貂和狐貍產(chǎn)生可檢測(cè)VNAs反應(yīng),可能需多次免疫或?qū)LPs純化才能獲得理想的免疫效果。第四章:犬用金絲雀痘病毒重組犬瘟熱疫苗大熊貓實(shí)驗(yàn)免疫研究。金絲雀痘病毒重組活載體是一種非復(fù)制型載體,接種哺乳動(dòng)物后外源基因可進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)而不能形成感染性子代病毒,是一種安全有效的病毒載體。目前,梅里亞公司已成功研發(fā)多種表達(dá)CDV弱毒疫苗株F和H基因的重組金絲雀痘病毒活載體疫苗。本研究選擇商品化犬用金絲雀痘病毒重組犬瘟熱活載體疫苗“Recombitek?CDV”,分別按兩種不同的免疫策略對(duì)來(lái)自某研究中心的23只大熊貓和某研究基地的37只大熊貓進(jìn)行實(shí)驗(yàn)免疫,通過(guò)檢測(cè)免疫動(dòng)物的血清抗體效價(jià)評(píng)估該疫苗的免疫效果。結(jié)果顯示:犬用重組犬瘟熱疫苗可以誘導(dǎo)大熊貓產(chǎn)生中和抗體。經(jīng)過(guò)兩次疫苗免疫后,某研究中心的23只大熊貓無(wú)論有無(wú)預(yù)存抗體均全部能檢測(cè)到CDV VNAs,平均值分別為65.1、33.1,范圍為8-256;某研究基地的37只大熊貓中有9只可以檢測(cè)到CDV VNAs,效價(jià)范圍為8-32。進(jìn)一步依據(jù)抗體陽(yáng)性率和中和抗體水平高低確定最佳免疫策略為:初次免疫對(duì)有初始抗體的大熊貓接種1頭份/只,無(wú)初始抗體的大熊貓接種2頭份/只,3周后加強(qiáng)免疫一次,劑量為1頭份/只。
[Abstract]:In recent years , there have been a significant increase in the number of giant panda population and the genetic evolution of wild giant panda . In the last few years , we have found that CDV is the only effective measure to prevent the infection of giant panda . In order to evaluate the immunogenicity of inactivated vaccine , the results showed that the vaccine could induce specific neutralizing antibody against CDV vaccine . The results showed that the vaccine could induce humoral and cellular immunity , and it could induce humoral and cellular immunity . In this study , 23 giant pandas from a research center and 37 giant pandas from a research base were immunized by two different immune strategies .

【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S858.93

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本文編號(hào)：1737064