本文選題：硬脂酰輔酶A去飽和酶1　切入點：脂肪酸代謝相關(guān)基因　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學》2015年博士論文

【摘要】：硬脂酰輔酶A去飽和酶1(SCD1)是Δ-9去飽和酶,能夠催化C14～C19飽和脂肪酸生成相應(yīng)的單不飽和脂肪酸(MUFA),在調(diào)控脂肪酸合成過程中具有重要的作用。SCD1蛋白主要以硬脂酸(C18:0)和棕櫚酸(C16:0)為底物,催化其生成油酸(C18:1 n-9)和棕櫚油酸(C16:1 n-7);同時還能催化trans11-C18:1(t11-C18:1)生成cis9,trans11-共扼亞油酸(c9,t11-CLA)。MUFA和共扼亞油酸(CLA)具有調(diào)節(jié)血液中膽固醇含量,防止心血管疾病,提高免疫力等作用,因此,這類不飽和脂肪酸有益于人類的身體健康。SCD1是MUFA合成過程的關(guān)鍵酶,提高乳腺中SCD1蛋白的表達量或活性可以有效的提高乳中不飽和脂肪酸含量,同時降低飽和脂肪酸含量。目前,關(guān)于在奶山羊乳腺中特異性表達奶山羊硬脂酰輔酶A去飽和酶1基因(Scd1)的研究尚未見報道。鑒于此,本試驗以奶山羊Scd1基因為研究對象,首先,分離、純化奶山羊乳腺上皮細胞,建立檢測乳腺上皮細胞分泌功能的綠色熒光蛋白報告系統(tǒng);其次,克隆Scd1基因編碼區(qū)序列并驗證其表達產(chǎn)物的生物學活性;然后,探究Scd1基因?qū)θ橄偕掀ぜ毎兄舅岽x相關(guān)基因表達的影響;最后,構(gòu)建Scd1基因乳腺特異性表達載體,并在體外培養(yǎng)的乳腺上皮細胞中驗證該載體的有效性。主要研究結(jié)果如下:1.奶山羊乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)及熒光報告系統(tǒng)的建立保留乳腺分泌特性的奶山羊乳腺上皮細胞是研究乳腺發(fā)育、分化、退化以及乳腺生物反應(yīng)器的理想模型。本試驗旨在分離培養(yǎng)奶山羊乳腺上皮細胞、優(yōu)化細胞培養(yǎng)條件并建立一種更加簡便、有效地檢測乳腺上皮細胞分泌功能的熒光報告系統(tǒng)。首先,采用組織塊培養(yǎng)法和胰酶消化法分離純化了奶山羊乳腺上皮細胞,比較了血清、ITS(胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒復(fù)合物)和胰島素對細胞生長曲線、細胞周期、細胞凋亡和轉(zhuǎn)染效率的影響。其次,將EGFP基因編碼區(qū)序列插入到含有山羊β-酪蛋白基因啟動子的pBC1載體中,構(gòu)建綠色熒光蛋白報告載體pBC1-EGFP,脂質(zhì)體介導法轉(zhuǎn)染奶山羊乳腺上皮細胞,采用RT-PCR法和熒光觀察法分別在RNA水平和蛋白水平檢測EGFP的表達。最后,為驗證熒光報告系統(tǒng)的有效性,采用免疫熒光法和Western blot法分別檢測乳腺上皮細胞的純度和分泌特性。結(jié)果顯示,分離純化的乳腺上皮細胞生長狀態(tài)良好,細胞形態(tài)呈鵝卵型;通過比較不同培養(yǎng)條件下,細胞的增殖、周期、凋亡和轉(zhuǎn)染效率,選定10ITS組(10%FBS+1%ITS+5μg/mL氫化可的松+10 ng/mL EGF)作為后續(xù)試驗中奶山羊乳腺上皮細胞的培養(yǎng)條件;EGFP基因能夠在乳腺上皮細胞中誘導表達;在乳腺上皮細胞中,細胞角蛋白18強表達,波形蛋白有微弱表達;乳腺上皮細胞能夠合成β-酪蛋白。以上結(jié)果表明:(1)分離、純化的奶山羊乳腺上皮細胞具有分泌功能,可以作為后續(xù)試驗的細胞模型;(2)β-酪蛋白啟動子驅(qū)動的綠色熒光蛋白報告系統(tǒng),可以有效地檢測乳腺上皮細胞的分泌功能,為今后鑒定乳腺上皮細胞分泌特性提供了一種簡便、有效的熒光報告系統(tǒng)。2.Scd1基因克隆及其表達產(chǎn)物的生物學活性研究為獲得Scd1基因CDS區(qū)序列,并在細胞中驗證其表達產(chǎn)物的生物學活性。本試驗采用RT-PCR法從泌乳期薩能奶山羊乳腺組織中擴增得到Scd1基因編碼區(qū)全序列,并克隆至pMD(?)19-T載體上,構(gòu)建了pMD-SCD1載體,測序分析Scd1基因的序列。以pEGFP-N1為骨架載體,構(gòu)建Scd1基因融合表達載體pN1-SCD1,轉(zhuǎn)染乳腺上皮細胞,通過EGFP熒光表達情況,研究SCD1蛋白在細胞中的定位。同時,以pIRES2-EGFP載體為骨架,構(gòu)建Scd1基因的真核表達載體pSCD1-EGFP,脂質(zhì)體介導法轉(zhuǎn)染奶山羊耳成纖維細胞,實時熒光定量PCR法檢測Scd1基因在mRNA水平的表達,氣相色譜法分析SCD1蛋白對細胞脂肪酸組成的影響。測序結(jié)果顯示:所獲得的Scd1基因CDS區(qū)序列與Gene Bank公布的序列同源性為100%;SCD1-EGFP融合蛋白熒光表達結(jié)果顯示:SCD1蛋白定位在細胞質(zhì)中;qRT-PCR結(jié)果顯示:在轉(zhuǎn)染pSCD1-EGFP載體的耳成纖維細胞中,Scd1基因mRNA的表達量是對照組的16.5倍;脂肪酸分析結(jié)果顯示:過表達Scd1基因后,顯著提高了細胞內(nèi)棕櫚油酸(16:1n-7,1.73±0.02%vs.2.54±0.02%,P0.01)和油酸(18:1 n-9,27.25±0.13%vs.30.37±0.04%,P0.01)的含量。本試驗克隆得到了Scd1基因的CDS區(qū)序,并證實了該基因的表達產(chǎn)物具有生物學活性。為研究Scd1基因在脂肪酸代謝中的功能及Scd1乳腺特異性表達載體的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。3.Scd1基因?qū)χ舅岽x相關(guān)基因表達的影響乳腺中,與乳脂合成、分解和調(diào)控相關(guān)的基因眾多,形成復(fù)雜的脂代謝基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。然而,關(guān)于Scd1基因?qū)ζ渌舅岽x相關(guān)基因表達影響的研究較少。本試驗采用過表達和干擾Scd1基因法,在奶山羊乳腺上皮細胞中,研究了Scd1基因?qū)χ舅岽x相關(guān)基因表達水平的影響。首先,以pCAGGS為骨架載體,構(gòu)建了pCAG-SCD1過表達載體,通過PCR、酶切和測序,鑒定了載體構(gòu)建的正確性。其次,設(shè)計、合成了3對Scd1 siRNA序列并篩選出高效的干擾序列,將Scd1基因過表達載體和干擾序列分別轉(zhuǎn)染乳腺上皮細胞,采用qRT-PCR法檢測脂肪酸代謝相關(guān)基因表達的變化。qRT-PCR結(jié)果顯示,過表達Scd1基因后,甘油三酯合成相關(guān)基因(Agpat6、Dgat1)和脂滴形成相關(guān)基因(Adrp、Tip47)的表達顯著上升;干擾Scd1基因表達后,甘油三酯合成相關(guān)基因(Gpam)和脂滴形成相關(guān)基因(Adrp、Tip47)的表達則顯著下降。結(jié)果表明,Scd1基因可能參與調(diào)控了甘油三酯和脂滴形成相關(guān)基因的表達,進而影響了甘油三酯的合成和脂滴的形成。本試驗為進一步研究Scd1基因在脂肪酸代謝中的重要功能奠定了基礎(chǔ)。4.Scd1基因乳腺特異性表達載體構(gòu)建及其在乳腺上皮細胞中表達研究若提高乳腺中Scd1基因的表達量或活性,可以有效地增加乳中不飽和脂肪酸的含量,并降低飽和脂肪酸的含量。本試驗旨在構(gòu)建Scd1基因乳腺特異性表達載體并在體外驗證該載體的有效性,為轉(zhuǎn)Scd1基因奶山羊的制備提供有效載體。首先,將已克隆的薩能奶山羊Scd1基因插入到含有山羊β-酪蛋白基因調(diào)控序列的pBC1載體中,獲得重組載體pBC1-SCD1。同時,為了后期轉(zhuǎn)基因供體細胞篩選的需要,將新霉素抗性基因(Neo)和綠色熒光蛋白(EGFP)基因插入到pBC1-SCD1載體中,并在標記基因兩側(cè)插入了用于標記基因刪除的LoxP同向重復(fù)序列,獲得載體pBC1-SCD1-LNIE。然后,將鑒定正確的pBC1-SCD1-LNIE載體,采用脂質(zhì)體介導法轉(zhuǎn)染奶山羊乳腺上皮細胞,經(jīng)催乳素誘導培養(yǎng),qRT-PCR和Western blot法檢測Scd1基因的表達,驗證載體的有效性。PCR、酶切和測序鑒定結(jié)果表明,成功構(gòu)建了Scd1基因乳腺特異性表達載體pBC1-SCD1-LNIE;qRT-PCR結(jié)果顯示,Scd1轉(zhuǎn)染組中Scd1基因的mRNA表達量是對照組的14.1倍;Western blot結(jié)果顯示,Scd1轉(zhuǎn)染組中SCD1蛋白的表達量是對照組的7倍。本試驗成功構(gòu)建了Scd1基因乳腺特異性表達載體,并證實該載體能夠在乳腺上皮細胞中誘導表達。為后續(xù)轉(zhuǎn)Scd1基因克隆奶山羊供體細胞的制備及富含不飽和脂肪酸羊乳的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:SCD1 was used as substrate to catalyze the formation of oleic acid ( C18 : 1 n - 9 ) and oleic acid ( C16 : 1 n - 7 ) . In order to study the effect of the Scd1 gene on the expression of fatty acid metabolism in mammary epithelial cells , the expression quantity or activity of SCD1 protein in mammary gland epithelial cells was studied . The expression of Scd1 gene was determined by RT - PCR . The results showed that the expression of Scd1 gene was 16 . 5 times higher than that of the control group . The expression of Scd1 gene in mammary gland epithelial cells was studied by PCR , digestion and sequencing . The results showed that the Scd1 gene was inserted into pBC1 - SCD1 vector containing goat 尾 - casein gene . The expression of Scd1 gene in Scd1 transfected group was 14.1 times that of the control group . Western blot showed that the expression of SCD1 protein in Scd1 transfected group was 7 times that of the control group . This experiment successfully constructed Scd1 gene mammary gland specific expression vector and confirmed that the vector was able to induce expression in mammary epithelial cells .

【學位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S827

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本文編號：1727807