本文選題：雄性生殖干細(xì)胞(mGSCs)　切入點(diǎn)：IGF-1　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：雄性生殖干細(xì)胞(male germline stem cells,m GSCs)是存在于睪丸曲細(xì)精管中具有自我更新潛力和終生生精功能的干細(xì)胞。它通過自我更新和分化維持自身數(shù)目的穩(wěn)定,并且通過精子的發(fā)生源源不斷的產(chǎn)生精子。雄性生殖干細(xì)胞(m GSCs)也稱精原干細(xì)胞,它在睪丸中占非常小的比例,大概在0.02%-0.03%左右,并且很難在體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)。目前,關(guān)于小鼠精原干細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)體系以及自我更新和分化的機(jī)制已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展,但是對(duì)于家畜動(dòng)物的長(zhǎng)期培養(yǎng)體系及其自我更新和分化的機(jī)制研究仍然非常有限。在本研究中,我們通過轉(zhuǎn)導(dǎo)SV40大T抗原到牛雄性生殖干細(xì)胞中,建立了一個(gè)穩(wěn)定的永生化牛雄性生殖干細(xì)胞系。永生化后的m GSCs增殖明顯加快。在m RNA和蛋白水平,其表達(dá)精原干細(xì)胞的特異性基因,如PLZF,PGP9.5,VASA,Lin28A和CD49F。這些細(xì)胞并能在體外被誘導(dǎo)分化成三個(gè)胚層的細(xì)胞類型,且具有啟動(dòng)減數(shù)分裂的潛力。永生化m GSC細(xì)胞系還能在白消安誘導(dǎo)的生精障礙小鼠的曲細(xì)精管中增殖并形成克隆。此外,我們以永生化m GSCs為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)IGF-1信號(hào)通路對(duì)牛m GSCs的生存具有重要作用,當(dāng)IGF-1信號(hào)通路被阻斷時(shí),m GSCs的增殖受到抑制,且細(xì)胞凋亡增加。在本研究中,還發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19能夠調(diào)控IGF-1信號(hào)通路,從而調(diào)控了m GSCs的增殖和凋亡。1.牛雄性生殖干細(xì)胞體外分離純化、鑒定牛雄性生殖干細(xì)胞通過THY1(又名CD90)抗體磁珠分選純化獲得,磁珠分選后的陽性細(xì)胞GFRA-1和THY1陽性細(xì)胞率明顯高于陰性細(xì)胞。經(jīng)過形態(tài)學(xué)、PCR和免疫熒光染色方法鑒定,這些純化后的細(xì)胞表達(dá)雄性生殖干細(xì)胞特異性標(biāo)記基因PLZF、GFRA-1、PGP9.5(又名UCHL-1)、LIN28A,生殖細(xì)胞標(biāo)記基因:VASA,多能性標(biāo)記基因:OCT-4、NANOG、SOX-2、KLF-4,自我更新標(biāo)記基因ETV-5。這些結(jié)果表明,我們所分離純化的細(xì)胞符合雄性生殖干細(xì)胞的典型特征。2.永生化牛雄性生殖干細(xì)胞的生物學(xué)特性鑒定分離純化后的牛m GSCs通過轉(zhuǎn)導(dǎo)含SV40大T抗原的載體(p LOX-Ttag-ires-TK),連續(xù)培養(yǎng)傳代超過三個(gè)月實(shí)現(xiàn)永生化。永生化的m GSCs表現(xiàn)出增殖加快,對(duì)血清、細(xì)胞因子等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求降低。經(jīng)過PCR、免疫熒光染色方法和western blot方法鑒定,永生化細(xì)胞能夠表達(dá)m GSCs特異性標(biāo)記基因PLZF、CD49F、LIN28A、PGF9.5等。生殖細(xì)胞標(biāo)記基因:VASA。多能性標(biāo)記基因:OCT-4、NANOG、SOX-2、KLF-4。自我更新標(biāo)記基因ETV-5。在體外分化能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中,牛m GSCs在體外誘導(dǎo)分化后能夠表達(dá)外胚層細(xì)胞標(biāo)記基因(PDX-1)、中胚層細(xì)胞標(biāo)記基因(ASM)、內(nèi)胚層細(xì)胞標(biāo)記基因(NESTIN)的標(biāo)記基因。此外,在維甲酸(RA)刺激下,永生化的牛m GSCs的減數(shù)分裂標(biāo)記基因STRA8、SYCP3、DAZL、ESCO2相對(duì)于對(duì)照組表達(dá)上調(diào),免疫熒光結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組表達(dá)減數(shù)分裂標(biāo)記基因STRA8、SYCP3、DAZL、ESCO2的陽性細(xì)胞率多于對(duì)照組。3.長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19通過IGF-1信號(hào)通路調(diào)控永生化牛雄性生殖干細(xì)胞的增殖與凋亡在本研究中,我們以永生化mGSCs為研究對(duì)象。通過添加不同濃度的細(xì)胞因子IGF-1(20 ng/m L、40 ng/m L、60 ng/m L),結(jié)果證實(shí)40 ng/m L的IGF-1時(shí)夠顯著促進(jìn)m GSCs的增殖,且增殖效應(yīng)呈現(xiàn)濃度劑量依賴關(guān)系。我們進(jìn)一步采用IGF-1特異性受體抑制劑(PPP)阻斷牛精原干細(xì)胞的IGF-1信號(hào)通路,通過CCK-8、EDU標(biāo)記實(shí)驗(yàn)、western blot、流式細(xì)胞數(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率等,結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGF-1信號(hào)通路被阻斷后牛m GSCs的增殖明顯被抑制,細(xì)胞凋亡增加。進(jìn)一步通過Si RNA干擾片段干擾長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19后,發(fā)現(xiàn)IGF-1信號(hào)通路能夠被抑制,細(xì)胞增殖受到抑制。本研究建立了一個(gè)穩(wěn)定的永生化牛雄性生殖干細(xì)胞系,并初步探討了長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19能夠調(diào)控IGF-1信號(hào)通路,并在牛雄性生殖干細(xì)胞的增殖和凋亡中發(fā)揮著重要作用,為深入研究雄性動(dòng)物雄性生殖干細(xì)胞的自我更新機(jī)制奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S823

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1723068