本文選題：雄性生殖干細胞(mGSCs)　切入點：IGF-1　出處：《西北農(nóng)林科技大學》2017年碩士論文

【摘要】：雄性生殖干細胞(male germline stem cells,m GSCs)是存在于睪丸曲細精管中具有自我更新潛力和終生生精功能的干細胞。它通過自我更新和分化維持自身數(shù)目的穩(wěn)定,并且通過精子的發(fā)生源源不斷的產(chǎn)生精子。雄性生殖干細胞(m GSCs)也稱精原干細胞,它在睪丸中占非常小的比例,大概在0.02%-0.03%左右,并且很難在體外長期傳代培養(yǎng)。目前,關(guān)于小鼠精原干細胞的長期培養(yǎng)體系以及自我更新和分化的機制已經(jīng)取得了一定的進展,但是對于家畜動物的長期培養(yǎng)體系及其自我更新和分化的機制研究仍然非常有限。在本研究中,我們通過轉(zhuǎn)導(dǎo)SV40大T抗原到牛雄性生殖干細胞中,建立了一個穩(wěn)定的永生化牛雄性生殖干細胞系。永生化后的m GSCs增殖明顯加快。在m RNA和蛋白水平,其表達精原干細胞的特異性基因,如PLZF,PGP9.5,VASA,Lin28A和CD49F。這些細胞并能在體外被誘導(dǎo)分化成三個胚層的細胞類型,且具有啟動減數(shù)分裂的潛力。永生化m GSC細胞系還能在白消安誘導(dǎo)的生精障礙小鼠的曲細精管中增殖并形成克隆。此外,我們以永生化m GSCs為研究對象,發(fā)現(xiàn)IGF-1信號通路對牛m GSCs的生存具有重要作用,當IGF-1信號通路被阻斷時,m GSCs的增殖受到抑制,且細胞凋亡增加。在本研究中,還發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA H19能夠調(diào)控IGF-1信號通路,從而調(diào)控了m GSCs的增殖和凋亡。1.牛雄性生殖干細胞體外分離純化、鑒定牛雄性生殖干細胞通過THY1(又名CD90)抗體磁珠分選純化獲得,磁珠分選后的陽性細胞GFRA-1和THY1陽性細胞率明顯高于陰性細胞。經(jīng)過形態(tài)學、PCR和免疫熒光染色方法鑒定,這些純化后的細胞表達雄性生殖干細胞特異性標記基因PLZF、GFRA-1、PGP9.5(又名UCHL-1)、LIN28A,生殖細胞標記基因:VASA,多能性標記基因:OCT-4、NANOG、SOX-2、KLF-4,自我更新標記基因ETV-5。這些結(jié)果表明,我們所分離純化的細胞符合雄性生殖干細胞的典型特征。2.永生化牛雄性生殖干細胞的生物學特性鑒定分離純化后的牛m GSCs通過轉(zhuǎn)導(dǎo)含SV40大T抗原的載體(p LOX-Ttag-ires-TK),連續(xù)培養(yǎng)傳代超過三個月實現(xiàn)永生化。永生化的m GSCs表現(xiàn)出增殖加快,對血清、細胞因子等營養(yǎng)物質(zhì)的需求降低。經(jīng)過PCR、免疫熒光染色方法和western blot方法鑒定,永生化細胞能夠表達m GSCs特異性標記基因PLZF、CD49F、LIN28A、PGF9.5等。生殖細胞標記基因:VASA。多能性標記基因:OCT-4、NANOG、SOX-2、KLF-4。自我更新標記基因ETV-5。在體外分化能力檢測實驗中,牛m GSCs在體外誘導(dǎo)分化后能夠表達外胚層細胞標記基因(PDX-1)、中胚層細胞標記基因(ASM)、內(nèi)胚層細胞標記基因(NESTIN)的標記基因。此外,在維甲酸(RA)刺激下,永生化的牛m GSCs的減數(shù)分裂標記基因STRA8、SYCP3、DAZL、ESCO2相對于對照組表達上調(diào),免疫熒光結(jié)果顯示實驗組表達減數(shù)分裂標記基因STRA8、SYCP3、DAZL、ESCO2的陽性細胞率多于對照組。3.長鏈非編碼RNA H19通過IGF-1信號通路調(diào)控永生化牛雄性生殖干細胞的增殖與凋亡在本研究中,我們以永生化mGSCs為研究對象。通過添加不同濃度的細胞因子IGF-1(20 ng/m L、40 ng/m L、60 ng/m L),結(jié)果證實40 ng/m L的IGF-1時夠顯著促進m GSCs的增殖,且增殖效應(yīng)呈現(xiàn)濃度劑量依賴關(guān)系。我們進一步采用IGF-1特異性受體抑制劑(PPP)阻斷牛精原干細胞的IGF-1信號通路,通過CCK-8、EDU標記實驗、western blot、流式細胞數(shù)檢測細胞凋亡率等,結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGF-1信號通路被阻斷后牛m GSCs的增殖明顯被抑制,細胞凋亡增加。進一步通過Si RNA干擾片段干擾長鏈非編碼RNA H19后,發(fā)現(xiàn)IGF-1信號通路能夠被抑制,細胞增殖受到抑制。本研究建立了一個穩(wěn)定的永生化牛雄性生殖干細胞系,并初步探討了長鏈非編碼RNA H19能夠調(diào)控IGF-1信號通路,并在牛雄性生殖干細胞的增殖和凋亡中發(fā)揮著重要作用,為深入研究雄性動物雄性生殖干細胞的自我更新機制奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
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【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S823

【參考文獻】

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本文編號：1723068