本文選題：鴨疫里默氏菌　切入點：脂多糖合成基因　出處：《四川農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：鴨疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer, RA)主要引起鴨、鵝、火雞以及其他禽類嚴(yán)重的敗血癥。鴨感染該病后以典型的纖維素性滲出為主要特征,病變主要體現(xiàn)為纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎及腦膜炎等。該病在世界范圍內(nèi)廣泛分布,給養(yǎng)禽業(yè)帶來重大的經(jīng)濟損失。該菌血清型眾多,且不同血清型之間不產(chǎn)生交叉保護力,對該病的致病機制研究較少。因此,在生產(chǎn)上,對該病的預(yù)防及治療相當(dāng)困難。脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS),亦稱內(nèi)毒素,是細(xì)菌的重要致病因子之一。目前就脂多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu),生物合成,遺傳調(diào)控、致病機制以及免疫等方面受到廣泛的關(guān)注。對大腸桿菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌等致病菌的脂多糖結(jié)構(gòu)認(rèn)識較為清楚,可以為病原菌的預(yù)防及治療提供新的途徑。目前就鴨疫里默氏菌的脂多糖結(jié)構(gòu)、合成及遺傳調(diào)控尚未見相關(guān)報道。為了研究鴨疫里默氏菌分子致病機制,本實驗構(gòu)建了脂多糖合成修飾基因的缺失株,初步研究了lpsA基因與脂多糖合成及細(xì)菌致病性的關(guān)系。lpsA基因編碼一種脂多糖合成修飾蛋白,功能預(yù)測顯示該基因在RA脂多糖合成過程中起糖基轉(zhuǎn)移作用,屬于糖基轉(zhuǎn)移酶超家族GTB型。本研究主要采用自殺質(zhì)粒同源重組的基因缺失手段成功構(gòu)建了血清1型鴨疫里默氏菌的lpsA基因突變株。首先采用PCR分別擴增出RA CH-1的lpsA基因上下游各600bp左右的片段,同時以pYES1 new質(zhì)粒擴增壯觀霉素抗性基因片段,然后利用重疊PCR,將3個片段形成融合片段,再與自殺性質(zhì)粒pYA4278相連。通過雙親濾膜結(jié)合轉(zhuǎn)移法,將構(gòu)建好的自殺性質(zhì)粒導(dǎo)入RACH-1株,通過同源重組將抗性片段替換lpsA目的基因構(gòu)建缺失株。然后通過對缺失株及親本株的生物學(xué)特性進行比較研究,其中包括測定生長曲線、API 20NE及Biolog生化鑒定、藥敏實驗、遺傳穩(wěn)定性、細(xì)胞黏附及侵襲力以及LDso測定等。同時采用多種提取方法提取了親本株及突變株的脂多糖,通過SDS-PAGE、銀染以研究lpsA基因?qū)χ嗵墙Y(jié)構(gòu)的影響。此外,本實驗還以熱酚水法粗提的RA的脂多糖為免疫原制備了兔抗脂多糖的高免血清。利用制備的抗血清,進行親本株及缺失株與抗體的凝集試驗。實驗結(jié)果表明lpsA基因缺失后,對RA菌株的生長、毒力等影響不顯著,但對菌株的生化特性及耐藥性等有一定影響,即缺失株不能發(fā)酵或利用某些碳源物質(zhì),包括酸化葡萄糖、D-果糖、D-半乳糖、D-海藻糖等。同時對磺胺異惡唑、氟苯尼考、諾氟沙星等抗生素的耐受性減弱。通過對粗提的脂多糖進行SDS-PAGE凝膠電泳、銀染,初步研究結(jié)果顯示,lpsA基因缺失株的脂多糖銀染條帶與親本株沒有明顯差異。以RA親本株脂多糖制備的多克隆抗體能與lpsA基因缺失株發(fā)生凝集反應(yīng)。結(jié)論：lpsA基因缺失后,RA菌株的生長、毒力等不受影響。IpsA基因缺失株脂多糖銀染條帶與親本株相似,脂多糖抗原性未發(fā)生變化。該基因參與了菌體的糖代謝過程,但是它在RA脂多糖合成及修飾過程中的具體功能還有待深入研究。
[Abstract]:Riemerlla antipestifer (Riemerella anatipestifer RA) is mainly caused by the ducks, geese, turkeys and other poultry. Severe sepsis duck infected with the disease with typical fibrinous lesions as the main feature, mainly reflected the fibrinous pericarditis, perihepatitis, airsacculitis and meningitis. The disease is widely distributed in the world the poultry industry, bring significant economic losses. The bacteria in many serotypes, and cross protection is not generated between different serotypes, of less study on pathogenic mechanism of the disease. Therefore, in practice, it is difficult to prevention and treatment of the disease. Lipopolysaccharide (Lipopolysaccharide, LPS), also called endotoxin, is one of the an important pathogenic factor of bacteria. The chemical structure, lipopolysaccharide biosynthesis, genetic regulation, pathogenic mechanism and immune aspects of attention. In Escherichia coli, Salmonella, Pseudomonas aeruginosa Such as the structure of lipopolysaccharide pathogen clear understanding, can provide a new way for the prevention and treatment of pathogens. The LPS structure of Riemerella anatipestifer, synthesis and genetic regulation has not been reported. In order to study the molecular mechanism of Riemerella anatipestifer, this experiment was constructed to modify gene deletion mutant lipopolysaccharide synthesis a preliminary study on the lpsA gene, and lipopolysaccharide synthesis and pathogenicity of bacteria.LpsA gene encoding a lipopolysaccharide synthesis of modified protein, gene function prediction showed that the glycosyltransferases in RA lipopolysaccharide synthesis process, which belongs to the glycosyltransferase superfamily of type GTB. This research mainly adopts the Dutch act means gene deletion of homologous recombination plasmid the successful construction of the lpsA gene of Riemerella anatipestifer serotypes 1 mutant strains were amplified by PCR. The lpsA gene of RA CH-1 downstream of the 600bp pieces At the same time, with the pYES1 new plasmid amplification spectinomycin resistance gene fragment by overlapping PCR, then, 3 fragments form a fusion fragment, and is connected with the plasmid pYA4278. Dutch act combined transfer method by parent membrane, the constructed plasmid into RACH-1 strain Dutch act, through homologous recombination fragment will replace the lpsA resistance to gene deletion strains. Then through the comparative study on the biological characteristics of mutant and parental strains, including the determination of growth curve, API 20NE and Biolog biochemical identification, drug sensitivity test, genetic stability, cell adhesion and invasion force and determination of LDso. At the same time using a variety of extraction methods of the parental strain and mutant strain lipopolysaccharide, by SDS-PAGE silver staining to study effects of lpsA gene on LPS structure. In addition, this experiment also to lipopolysaccharide hot phenol water extract of RA Rabbit anti lipopolysaccharide preparation of immunogens The hyperimmune serum. Using antiserum agglutination test, strain and parental strain and antibodies were missing. The experimental results show that lpsA gene deletion, the growth of strain RA, the toxicity was not affected, but has a certain effect on the biochemical characteristics of strains and drug resistance, the mutant can not ferment or use some carbon the source material, including acid glucose, D- fructose, D- galactose, D- trehalose and so on. At the same time, sulfamethoxazole, florfenicol, tolerance decreased norfloxacin antibiotics. Through SDS-PAGE gel electrophoresis, silver staining of the crude lipopolysaccharide, preliminary results show that the lpsA gene deletion mutant lipopolysaccharide a silver staining and there is no significant difference in parental strain. The polyclonal antibody was prepared by lipopolysaccharide RA parental can agglutinate with lpsA gene deletion strains. Conclusion: lpsA gene deletion strain RA, the growth of virulence was not affected by.IpsA The silver stained bands of LPS were similar to those of the parental strains, but the antigenicity of LPS was not changed. This gene is involved in the process of glucose metabolism, but its specific function in the process of RA lipopolysaccharide synthesis and modification is still to be further studied.

【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61

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本文編號：1713757