本文選題：鴿源禽毛滴蟲　切入點：G3蛋白　出處：《山東農業(yè)大學》2017年碩士論文

【摘要】：鴿源禽毛滴蟲又稱鴿毛滴蟲,屬鞭毛蟲綱、毛滴蟲科、毛滴蟲屬,其嗜好寄生部位是鴿消化道前段,引起各種消化道癥狀,導致鴿毛滴蟲病,本病沒有季節(jié)性,宿主對本病的敏感性沒有品種和日齡的差別,其中幼鴿對本病最為敏感,成年鴿抵抗力強,常呈無癥狀的隱性感染。蟲體寄生于粘膜上皮細胞間隙處,發(fā)病時表現為一層壞死性潰瘍覆蓋于口腔、食道、嗉囊、胃部粘膜之上,癥狀嚴重時粘膜外覆蓋黃色粗糙的干酪樣滲出物,導致患鴿呼吸和采食困難,口腔分泌物增多,眼觀癥狀比較直觀的是胸部羽毛臟亂,癥狀進一步發(fā)展會造成宿主死亡。目前治療本病常采用化學藥物,藥物對動物容易產生副作用,且抗藥蟲株很容易被藥物的選擇壓力下誘導產生。有必要深入了解疫苗相關蛋白分子,開發(fā)安全有效的防治方法。G3蛋白有多個開放閱讀框,具有良好的免疫原性,本研究將新型蛋白進行克隆表達,鑒定其免疫原性,評估其開發(fā)新型疫苗的可能性,為防控鴿毛滴蟲病提供新途徑。主要研究內容與結果如下:1.鴿源禽毛滴蟲G3(TgG3)蛋白的克隆及測序根據已上傳的陰道毛滴蟲G3(TvG3)蛋白部分基因序列ORF設計引物,提取鴿源禽毛滴蟲總RNA,反轉錄,經PCR擴增獲得TgG3蛋白基因序列。經TA克隆至pJET 1.2克隆質粒里,經生工測序,TgG3蛋白的ORF包含堿基序列1623bp,編碼540個氨基酸,蛋白質理論分子量為63.7千道爾頓。2.鴿源禽毛滴蟲G3(TgG3)蛋白的序列及生物信息學分析比對鴿源禽毛滴蟲G3(TgG3)蛋白與陰道毛滴蟲G3(TvG3)蛋白的堿基序列,兩者堿基同源性為78%,從5’端到3’端差異均勻分布,每隔幾個堿基就有差異出現,未檢索到TgG3堿基序列與其他蛋白有很大同源性。經氨基酸序列比對,鴿源禽毛滴蟲G3(TgG3)蛋白與陰道毛滴蟲G3(TvG3)蛋白氨基酸同源性達98%,氨基酸序列有9處不同。該蛋白與胎兒三毛滴蟲TRFO_13881蛋白氨基酸同源性達83%。使用生物信息學軟件對鴿源禽毛滴蟲G3(TgG3)蛋白氨基酸序列進行分析預測,顯示TgG3蛋白無前導肽和信號肽、有親水性、為堿性氨基酸、無GPI,有SMC結構域。3.鴿源禽毛滴蟲G3重組蛋白多克隆抗體的制備采用同源重組法,用CloneEZ PCR克隆試劑盒構建重組質粒pET28a-G3,將重組陽性質粒轉化至E.coli transetta中,IPTG誘導表達,將菌體超聲破碎,取包涵體用尿素溶解、經Ni柱純化。SDS-PAGE電泳顯示,原核表達的重組蛋白大小約為63.7KDa,與軟件預計的分子量大小相符。將純化后的原核表達鴿源禽毛滴蟲G3蛋白加佐劑免疫小鼠,制備多克隆抗體高免血清,用間接ELISA法檢測血清抗體效價。采用Westerm-blot鑒定分析G3重組蛋白的抗原性,制備的小鼠多抗能夠識別pET28a-G3原核表達的重組蛋白,原核表達的重組蛋白具有良好的抗原性。4.多抗與蟲體天然蛋白反應性檢測取對數生長期的蟲體裂解經蛋白質電泳,用抗G3蛋白小鼠多抗進行Western-blot,結果顯示,鴿源禽毛滴蟲蟲體中有分子量為63kDa左右的蛋白能夠被抗G3蛋白小鼠多抗識別,說明原核表達的G3重組蛋白有良好的免疫原性。本試驗經PCR擴增獲得鴿源禽毛滴蟲G3蛋白堿基序列,構建了原核表達重組質粒pET28a-G3并用transetta表達出分子量為63.7kDa的重組蛋白,免疫小鼠制備的多抗能夠識別原核表達的重組蛋白,說明重組蛋白抗原性良好。多抗與蟲體蛋白反應性良好,說明重組蛋白的免疫原性良好。
[Abstract]:In this study , the sequence of TgG3 ( TgG3 ) protein was cloned and sequenced . The results were as follows : 1 . The gene sequence of TgG3 protein was 1623bp . The recombinant plasmid pET28a - G3 was prepared by using CloneEZ PCR cloning kit . The recombinant plasmid pET28a - G3 was prepared by Western - blot .

【學位授予單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S858.39

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 蘇周;;鴿副粘病毒病和毛滴蟲病混合感染的診治報告[J];家禽科學;2016年08期

2 孫靜靜;姜夕s，

本文編號：1709504