本文選題：奶山羊　切入點(diǎn)：乳腺組織　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：奶山羊(Capra hircus)是一種重要的經(jīng)濟(jì)物種,且山羊乳的營(yíng)養(yǎng)成分及吸收效率均高于牛乳,因此適宜人們飲用并成為現(xiàn)代乳制品行業(yè)的一個(gè)重要原材料,由于山羊乳的特點(diǎn)和乳腺組織中的脂質(zhì)代謝密切相關(guān),因此對(duì)其乳腺組織的發(fā)育,泌乳及乳脂代謝進(jìn)行研究是極其必要的。然而目前針對(duì)山羊乳脂代謝的研究還較少,且大多都集中于基因功能的探究與分析,缺乏從轉(zhuǎn)錄后水平,如microRNAs(miRNAs)水平對(duì)其進(jìn)行研究。近年來(lái),隨著高通量測(cè)序技術(shù)以及生物信息學(xué)的發(fā)展,一系列的miRNAs被發(fā)掘并提交到miRBase中,然而,在miRBase 20.0數(shù)據(jù)庫(kù)(2013年6月)中,還沒(méi)有可以利用的山羊miRNAs序列,并且,在以往的研究中,由于沒(méi)有可利用的山羊基因組,因此山羊的solexa測(cè)序結(jié)果一般是與其近緣物種,如牛,綿羊等的基因組相比對(duì),來(lái)獲得其miRNA轉(zhuǎn)錄組。在本研究中,通過(guò)將solexa測(cè)序結(jié)果與山羊的基因組進(jìn)行比對(duì),從而獲得了更加可靠的山羊泌乳期miRNA轉(zhuǎn)錄組;通過(guò)對(duì)山羊miRNAs序列及其在山羊基因組上的定位分析,從而了解了山羊miRNA轉(zhuǎn)錄組特征;通過(guò)篩選并驗(yàn)證在不同泌乳時(shí)期差異表達(dá)的miRNAs,從而得到了一些可能對(duì)山羊乳腺發(fā)育,泌乳及乳脂代謝等具有重要的調(diào)控作用的miRNAs。主要結(jié)果如下:1、通過(guò)solexa測(cè)序技術(shù),在山羊泌乳中期乳腺組織中共檢測(cè)到了24479196個(gè)原始序列讀數(shù)(raw data),經(jīng)過(guò)一系列的質(zhì)量過(guò)濾后,最終得到了21517296個(gè)clean reads,占raw data的87.9%。對(duì)clean reads進(jìn)行長(zhǎng)度分析后發(fā)現(xiàn),clean reads的片段大小主要集中在21-23nt之間,且在22nt長(zhǎng)度處具有最多的序列讀數(shù)。將clean reads中相同的序列合并成一個(gè)unique reads,并與miRBase 20.0數(shù)據(jù)庫(kù)中已注釋的哺乳動(dòng)物的pre-miRNAs,mature miRNAs以及山羊的基因組進(jìn)行比對(duì),最終得到了1059個(gè)mature miRNAs和821個(gè)pre-miRNAs,其中成熟的miRNAs包括796個(gè)保守的mi RNAs以及263個(gè)新的miRNAs。2、對(duì)測(cè)序得到的1059個(gè)miRNAs進(jìn)行首位堿基的偏好性分析,結(jié)果顯示miRNAs的首位堿基對(duì)U有強(qiáng)烈的傾向性,而對(duì)G則有一定的抗性。對(duì)796個(gè)保守的miRNAs進(jìn)行序列分析,發(fā)現(xiàn)與已注釋的序列相比,山羊miRNAs序列大多在其3'端發(fā)生了變化,由此形成了多個(gè)miRNA變異體(isomiR),且山羊miRNA轉(zhuǎn)錄組中的大部分miRNAs都是以isomiR的形式存在的。3、將796個(gè)保守的miRNAs與mi RBase 20.0數(shù)據(jù)庫(kù)中的24種哺乳動(dòng)物的miRNAs進(jìn)行比對(duì),結(jié)果發(fā)現(xiàn)與其他物種相比,山羊與牛具有相同miRNAs的數(shù)目最多,為404個(gè),而山羊與綿羊具有同源miRNAs的數(shù)目則較少,僅為102個(gè)。4、將821個(gè)pre-miRNAs與山羊基因組的染色體序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果發(fā)現(xiàn)有796個(gè)pre-miRNAs可以比對(duì)到山羊的染色體序列上,對(duì)比對(duì)上的pre-miRNAs進(jìn)行進(jìn)一步的染色體密度分析,發(fā)現(xiàn)796個(gè)pre-miRNAs在山羊染色體上的分布密度在1.1-0.11/Mbp之間,其中9號(hào)染色體上pre-miRNA的密度最小,為0.11個(gè)/Mbp,而21號(hào)染色體上pre-miRNAs的密度最大,為1.1/Mbp。5、miRNAs在基因組上是成簇排列的,將基因間最大間距(maximum inter-distance,MID)分別定義為3Kb,5Kb,10Kb以及50Kb時(shí)對(duì)山羊的miRNA cluster進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)MID為3Kb時(shí),429個(gè)miRNAs形成了86個(gè)cluster;當(dāng)MID為5Kb時(shí),442個(gè)miRNAs形成了87個(gè)cluster;當(dāng)MID為10Kb時(shí),460個(gè)miRNAs可形成90個(gè)cluster;而當(dāng)MID為50Kb時(shí),501個(gè)miRNAs共形成了99個(gè)cluster。6、將種子序列完全相同的miRNAs定義為一個(gè)miRNA家族,對(duì)測(cè)序得到的1059個(gè)mi RNAs按其種子序列進(jìn)行家族分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),有479個(gè)miRNAs可以與其他miRNAs形成mi RNA家族,共形成了164個(gè)miRNA家族,其中最大的家族為包含有12個(gè)成員的let-7家族,而剩余的573個(gè)miRNAs由于不含有與其他miRNAs相同的種子序列,因此無(wú)法形成miRNA家族。7、通過(guò)對(duì)U2,18s rRNA,5s rRNA基因分別設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄及定量引物,并進(jìn)行定量檢測(cè)和擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定,最終確定5s rRNA為miRNA S-Poly(T)法定量檢測(cè)的內(nèi)參。8、通過(guò)將本次測(cè)序結(jié)果與已報(bào)道的研究成果相比對(duì),最終得到了37個(gè)在山羊乳腺組織不同泌乳時(shí)期差異表達(dá)的miRNAs,利用qPCR方法對(duì)這些miRNAs分別進(jìn)行泌乳前期、泌乳盛期、泌乳中期以及干奶期的乳腺組織表達(dá)水平檢測(cè),發(fā)現(xiàn)僅有miR-222_R+2在四個(gè)不同的泌乳時(shí)期內(nèi)沒(méi)有明顯的表達(dá)差異,而其余的36個(gè)miRNAs均存在著顯著的差異表達(dá)。9、通過(guò)在山羊乳腺上皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)mi R-145,并對(duì)其進(jìn)行油紅O染色和甘油三酯含量的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其不僅能夠顯著增加細(xì)胞中脂滴的含量,而且能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量的積累。結(jié)論:完成山羊泌乳期miRNA轉(zhuǎn)錄組的鑒定及特征分析,并篩選及初步驗(yàn)證了36個(gè)可能對(duì)山羊乳腺發(fā)育,泌乳及乳脂代謝等具有重要的調(diào)控作用的miRNAs。
[Abstract]:The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . With the development of high - throughput sequencing and bioinformatic development , there are 24479196 miRNA transcriptions in goat ' s breast tissue . In recent years , with high - throughput sequencing and bioinformatic development , a series of miRNA transcriptions have been obtained . In comparison with other species , we found that the first base pair U has a strong tendency towards U and has a certain resistance to G . It is found that when MID is 5 Kb , the number of pre - miRNA in the goat is smallest , which is only 102 . 4 . When MID is 10 Kb , there are 99 clusters . In the case of MID being 10 Kb , the number of the two hundred and ninety - nine microRNAs is defined as a miRNA family , and the 1059 mi RNAs obtained by sequencing are family analyzed according to their seed sequence , and the results are found . It was found that only miR - 222 _ R + 2 was able to significantly increase the content of lipid droplets in the cells of goat mammary gland , and it was found that only miR - 222 _ R + 2 was able to significantly increase the content of lipid droplets in the cells , and it was found that only miR - 222 _ R + 2 was able to significantly increase the content of lipid droplets in the cells , and to find out that only miR - 222 _ R + 2 had important regulatory effects on mammary gland development , lactation and milk fat metabolism .

【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S827

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本文編號(hào)：1708941