發(fā)布時(shí)間：2018-04-04 00:54

  本文選題：奶牛　切入點(diǎn)：乳腺　出處：《內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：本論文主要研究泌乳中期奶牛乳腺組織及乳腺上皮細(xì)胞中小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體(Pep Ts)的表達(dá)定位及其潛在功能的調(diào)控,目的是確定泌乳奶牛乳腺中存在哪些小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體,在乳腺上皮細(xì)胞攝取小肽時(shí)所起的作用、發(fā)生的變化及其機(jī)理的初步探討。從而為后期進(jìn)一步深入研究小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的分子功能及轉(zhuǎn)運(yùn)性能提供理論依據(jù),也為完善小肽的攝取代謝模型及乳蛋白前體物的合理配比模塊提供依據(jù)與積累資料。本論文主要包括四個(gè)試驗(yàn),其結(jié)果如下:1.泌乳奶牛乳腺中小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體m RNA水平的鑒定隨機(jī)采集三頭泌乳中期荷斯坦奶牛的乳腺組織,部分樣品進(jìn)行提取組織總RNA,其余用于乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng),分別運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法和瓊脂糖凝膠技術(shù),通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)泌乳動(dòng)物乳腺中重要的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體Pep T1、PepT2的表達(dá)。試驗(yàn)結(jié)果顯示:無(wú)論是在泌乳奶牛乳腺組織中還是乳腺上皮細(xì)胞中,兩種小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的引物都存在特異性的擴(kuò)增,并有著高度明顯的表達(dá);測(cè)序技術(shù)也證實(shí)了結(jié)果的可靠性,經(jīng)分析比對(duì)后發(fā)現(xiàn)與目標(biāo)序列同源性達(dá)到了100%,這說(shuō)明泌乳奶牛乳腺中存在PepTs基因的表達(dá)。2.泌乳奶牛乳腺中Pep Ts的免疫學(xué)檢測(cè)與定位首先從奶牛乳腺組織和體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中分別提取總蛋白,用Western Blot的方法檢測(cè)了小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體Pep T1、PepT2兩種蛋白的表達(dá),隨后制作切片采用IHC(免疫組織化學(xué))與ICC(免疫細(xì)胞化學(xué))試驗(yàn)技術(shù)分別在奶牛乳腺組織及乳腺上皮細(xì)胞中對(duì)PepTs的分布進(jìn)行了定位,最后用免疫熒光對(duì)結(jié)果進(jìn)行了進(jìn)一步證實(shí)。試驗(yàn)結(jié)果顯示:兩種小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白在泌乳奶牛乳腺中均有高強(qiáng)度的表達(dá),PepT1主要存在于奶牛乳腺的細(xì)胞膜上,PepT2則主要存在于奶牛乳腺的細(xì)胞質(zhì)中。3.奶牛乳腺中小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的理化特性規(guī)律及功能調(diào)控試驗(yàn)從奶牛乳腺組織中提取上皮細(xì)胞進(jìn)行純化培養(yǎng),命名為原代,待其生長(zhǎng)到總細(xì)胞數(shù)的80%~90%時(shí),以1×105個(gè)/孔的密度接種并進(jìn)行細(xì)胞傳代處理,一直傳到第五代,分別提取其總RNA進(jìn)行RT-PCR試驗(yàn),每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)6次。結(jié)果發(fā)現(xiàn):細(xì)胞培養(yǎng)代數(shù)對(duì)Pep Ts基因的表達(dá)影響顯著,其中第二代細(xì)胞相對(duì)于其它幾代,無(wú)論對(duì)PepT1,還是Pep T2的影響差異均顯著(P㩳0.05),所以后續(xù)試驗(yàn)均選用第二代乳腺上皮細(xì)胞。隨后設(shè)定不同的培養(yǎng)天數(shù)(第1 d~6 d)六個(gè)同一時(shí)間點(diǎn),以每組試驗(yàn)6個(gè)重復(fù),考察細(xì)胞分化過(guò)程中對(duì)PepTs基因表達(dá)的影響規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn):PepTs mRNA在奶牛乳腺上皮細(xì)胞上的表達(dá)是依賴時(shí)間進(jìn)程而變化的,呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì),并在第5天高度表達(dá)(P㩳0.05)。為了進(jìn)一步系統(tǒng)的研究泌乳奶牛乳腺中Pep Ts的調(diào)控規(guī)律,試驗(yàn)設(shè)計(jì)在培養(yǎng)基中添加不同濃度的泌乳相關(guān)激素(培養(yǎng)24 h)及不同的肽底物(48 h)進(jìn)行培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞。試驗(yàn)結(jié)果顯示:與不添加小肽、只添加游離氨基酸組相比,添加0.0002、0.002、0.02、0.2 IU/m L的Prolactin,50、500、5000 ng/m L的Insulin,100、1000 ng/m L的Hydrocortisone均可顯著的增加Pep Ts mRNA基因的表達(dá)(P㩳0.05);添加10%Thr-Phe-Phe,5%Phe-Phe,10%Leu-Leu和6μg/m L Leu-Leu時(shí),PepT1、PepT2及αs1 casion基因mRNA的豐度均表現(xiàn)最高(P㩳0.05),且有利于乳蛋白的合成。4.奶牛乳腺小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)泌乳奶牛小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體Pep T1基因采用PCR方法,進(jìn)行擴(kuò)增克隆,通過(guò)限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)和T4連接酶連接,重組質(zhì)粒,構(gòu)建真核表達(dá)載體并命名為p IRES2-EGFP-Pep T1。泌乳奶牛寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體PepT2委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成,命名為pc DNA3.1-Pep T2質(zhì)粒。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證比對(duì)無(wú)誤后將p IRES2-EGFP-Pep T1與pcDNA3.1-Pep T2轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細(xì)胞,用RT-PCR方法檢測(cè)單獨(dú)轉(zhuǎn)染后對(duì)小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的穩(wěn)定性及對(duì)乳蛋白基因表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示:成功構(gòu)建了奶牛乳腺I型小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的真核表達(dá)載體p IRES2-EGFP-Pep Ts與Ⅱ型小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Pep T2,完成了p IRES2-EGFP-Pep Ts與pcDNA3.1-PepT2真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細(xì)胞;轉(zhuǎn)染后得出,與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的乳腺上皮細(xì)胞中Pep Ts基因得到了高效的表達(dá),αs1 casein基因呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)。綜合本試驗(yàn)的研究結(jié)果可以得出,泌乳奶牛乳腺中不僅存在小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體Pep T2的表達(dá),也存在小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體PepT1的表達(dá),在奶牛乳腺組織和乳腺上皮細(xì)胞中分別從基因水平和蛋白水平驗(yàn)證了結(jié)果的可靠,兩種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都有高度的表達(dá),然后以奶牛乳腺上皮細(xì)胞為平臺(tái),系統(tǒng)的證實(shí)了細(xì)胞分化時(shí)期、泌乳相關(guān)激素及不同的肽底物均對(duì)PepTs的調(diào)控有顯著的影響,并呈現(xiàn)一定的規(guī)律,最后構(gòu)建了奶牛乳腺中小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體(p IRES2-EGFP-PepT1和pc DNA3.1-Pep T2),在核酸水平利用RT-PCR方法驗(yàn)證了表達(dá)的穩(wěn)定性,完成了p IRES2-EGFP-PepTs與pcDNA3.1-PepT2真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細(xì)胞,與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染后小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體和αs1酪蛋白基因均有了顯著的表達(dá)。
[Abstract]:The expression of Pep T 1 and PepT2 in the mammary gland of lactating dairy cow was studied by means of real - time fluorescence quantitative polymerase chain reaction ( RT - PCR ) and agarose gel technique . In order to study the regulation of Pep Ts in the mammary gland of lactating dairy cows , the expression of Pep Ts mRNA was increased significantly ( P ? 0.05 ) . The expression vector pIRES2 - EGFP - Pep - Ts and pcDNA3.1 - Pep - T2 were added to the mammary epithelial cells . The results showed that the expression vector pIRES2 - EGFP - Pep - Ts and pcDNA3.1 - Pep - T2 were successfully transfected into the mammary epithelial cells . The expression of the small peptide transport vector Pep _ ( 2 ) was observed in the mammary gland of the lactating dairy cow , and the expression of the small peptide transport vector ( PepT1 ) was also observed . At the same time , the expression of the small peptide transport vector ( pIRES2 - EGFP - PepT1 and pcDNA 3.1 - Pep _ 2 ) was verified by RT - PCR .

【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S823

【參考文獻(xiàn)】

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1 尤超;趙大球;梁乘榜;周春華;;PCR引物設(shè)計(jì)方法綜述[J];現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技;2011年17期

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1 張興夫;不同日糧模式對(duì)泌乳奶牛乳腺乳蛋白合成影響的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

2 周苗苗;奶牛乳腺中小肽的攝取及其在乳蛋白合成中的作用[D];浙江大學(xué);2011年

3 吳慧慧;必需氨基酸及蛋氨酸二肽供給模式對(duì)奶牛乳腺組織α_s-酷蛋白合成的影響[D];浙江大學(xué);2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 孫康玉;小肽對(duì)奶牛乳腺細(xì)胞乳蛋白合成的影響[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

2 來(lái)金良;必需氨基酸濃度對(duì)奶牛乳腺酪蛋白α_（s1）基因表達(dá)的影響[D];浙江大學(xué);2006年

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本文編號(hào)：1707660