本文選題：牛腺病毒3型　切入點：棉鼠肺成纖維細胞　出處：《西北農(nóng)林科技大學》2015年碩士論文

【摘要】：牛腺病毒(Bovine adenovirus,BAV),為腺病毒科(Adenoviridae)哺乳動物腺病毒屬(Mastadenovirus)的成員。目前已報道牛腺病毒總共有10個血清型,BAV-1、-2、-3、-9和-10型牛腺病毒屬于哺乳動物腺病毒屬(Mastadenovirus),而BAV-4、-5、-6、-7和-8型屬于腺胸腺病毒屬(Atadenovirus)。BAVs感染呈世界范圍內(nèi)廣泛流行,但是對BAVs在我國牛場的流行狀況目前仍不清楚。鑒于不同牛腺病毒血清型間存在血清交叉反應(yīng),使用一種血清型BAV可同時對多個血清型BAVs進行檢測,本研究以實驗室成熟應(yīng)用的3型牛腺病毒(BAV3)為檢測抗原,建立檢測牛腺病毒的間接ELISA方法,并以所建立間接ELISA對來自咸陽地區(qū)不同牛場2000多份血清進行牛腺病毒流行病學調(diào)查。取得的主要如下結(jié)果:1.全病毒抗原的制備及病毒滴度的測定通過0.1 MOI的BAV3接種棉鼠肺成纖維細胞(VIDO-DT1),對BAV3進行了大量擴增和病毒滴度測定。以測得TCID50值為106.47的BAV3為包被抗原原始濃度。2.間接ELISA檢測方法的優(yōu)化方陣滴定確定ELISA抗原最佳包被濃度為1:120,即106.47,血清稀釋液的最佳使用濃度為l:80,封閉液用5%的脫脂奶粉在37°C下作用60 min,酶標二抗的最適濃度為1:1200,37°C作用1.5 h,底物作用15 min后,加1 mol/L的H2SO4終止反應(yīng)。計算結(jié)果如下:30份陰性血清平均值(X)為0.1832,標準差(SD)為0.0657,確定陽性臨界點(X+3SD)為0.3803,陰性臨界點為(X+2SD)位0.3146。以該方法檢測�？谔阋哧栃匝�、牛傳染性鼻氣管炎陽性血清、牛肺疫陽性血清、牛結(jié)核病陽性血清、牛流行熱的標準陽性血清,以及BAV3的陽性,陰性血清。進行特異性試驗,結(jié)果只有BAV3的陽性血清為陽性,其余均為陰性。并對此ELISA方法進行重復試驗,批內(nèi)重復變異系數(shù)在3.8511%~7.5916%之間,變異系數(shù)(CV)5%;批間重復變異系數(shù)在4.0124%~8.7293%之間,變異系數(shù)(CV)5%。證明此ELISA方法進行重復性良好。從上述各個方面對所建立的ELISA方法進行優(yōu)化和改進,有效的提高了陽性值,并降低了陰性背景值,并驗證了所建立的ELISA方法的穩(wěn)定性。3.咸陽地區(qū)BAV3流行病學調(diào)查研究用建立的鑒別診斷間接ELISA方法對采集來自咸陽8個地區(qū)23個不同規(guī)模大小的牛場2000份牛血清進行了檢測,結(jié)果顯示:2000份牛樣品中陽性樣品數(shù)為933份,即整個樣品陽性率平均值為49.23%,陽性群體中陽性率最低為31.96%,最高達91.74%。試驗結(jié)果表明,可用于臨床BAV血清抗體的檢測。這為ELISA診斷試劑盒的研制開發(fā)奠定了基礎(chǔ),為建立規(guī)�；龅沫h(huán)境衛(wèi)生及BAV感染的快速診斷方法提供了科學依據(jù)。
[Abstract]:Bovine adenovirusBAV, a member of the mammal adenovirus genus Adenoviridaeae, is a member of the family Adenoviridae.However, the prevalence of BAVs in cattle farms in China is still unclear.In view of the existence of serum cross-reaction among different bovine adenovirus serotypes, BAVs of multiple serotypes can be detected simultaneously by using one serotype of BAV. In this study, bovine adenovirus type 3 (BAV3), which is used in laboratory, was used as the detection antigen.An indirect ELISA method for detection of bovine adenovirus was established, and an epidemiological survey of bovine adenovirus was carried out on more than 2000 sera from different cattle farms in Xianyang area with indirect ELISA.The main result is as follows: 1.The preparation of whole virus antigen and the determination of virus titer were carried out by inoculation of VIDO-DT1 with 0. 1 MOI BAV3 of cotton mouse lung fibroblasts. A large number of BAV3 was amplified and virus titer was determined.The original concentration of encapsulated antigen was BAV3 with TCID50 value of 106.47.Optimization of indirect ELISA titration method: the optimum coating concentration of ELISA antigen is 1: 120, that is 106.47, the optimal concentration of serum dilution solution is 1: 80, and the optimal concentration of enzyme labeled second antibody is 60 min with 5% skimmed milk powder at 37 擄C, and the optimal concentration of serum dilution solution is 1: 80 with 5% skim milk powder at 37 擄C for 60 min.1: 1200 擄C for 1.5 h and substrate for 15 min.The H2SO4 termination reaction with 1 mol/L was added.The calculated results are as follows: the average value of 30 negative sera is 0.1832, the standard deviation is 0.0657, the positive critical point is 0.3803, and the negative critical point is 0.3146.The positive serum of bovine foot and mouth disease, the positive serum of bovine infectious rhinotracheitis, the positive serum of bovine pulmonary disease, the positive serum of bovine tuberculosis, the standard positive serum of bovine epidemic fever, and the positive and negative serum of BAV3 were detected by this method.The specificity test showed that only the positive serum of BAV3 was positive and the others were negative.The repeat test of ELISA showed that the coefficient of variation was between 3.8511% and 7.5916%, and the coefficient of variation was 4.0124% and 8.7293%, respectively, and the coefficient of variation was higher than that of CV5.The coefficient of variation was 7.5916%, and the coefficient of variation was between 4.0124% and 8.7293%, respectively.It is proved that this ELISA method is reproducible.From the above aspects, the established ELISA method is optimized and improved, which effectively increases the positive value, reduces the negative background value, and verifies the stability of the established ELISA method. 3.BAV3 Epidemiological investigation in Xianyang area 2000 bovine serum samples from 23 cattle farms of different sizes from 8 districts of Xianyang were detected by indirect ELISA method for differential diagnosis.The results showed that the positive rate of the whole sample was 49.23, the lowest was 31.96 in the positive population, and the highest was 91.74. The results showed that the number of positive samples was 933, the average positive rate of the whole sample was 49.23, and the positive rate was 31.96 in the positive population.The results show that it can be used to detect the serum antibody of BAV.It lays a foundation for the research and development of ELISA diagnostic kit and provides a scientific basis for the establishment of a rapid diagnostic method for environmental hygiene and BAV infection in large scale cattle farms.
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S855.3

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本文編號：1701170