本文選題：鴨腸炎病毒　切入點(diǎn)：UL基因　出處：《中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)》2016年14期

【摘要】：【目的】鴨腸炎病毒(duck enteritis virus,DEV)不同毒株間存在明顯差異,DEV疫苗株的UL2基因在195bp后連續(xù)缺失528bp,導(dǎo)致第65位氨基酸后連續(xù)缺失176aa~([1])。將綠色熒光蛋白(GFP)基因插入DEV UL2基因中,獲得表達(dá)綠色熒光蛋白的重組病毒,以研究UL2基因?qū)EV生物特性的影響和探討DEV作為載體表達(dá)外源基因的可行性。【方法】以實(shí)驗(yàn)室保存的DEV細(xì)胞適應(yīng)株DNA為模板,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出病毒UL2基因上下游序列并克隆入pMD-18T載體;以UL2基因作為外源基因插入靶點(diǎn)及同源重組臂,將CMV啟動(dòng)子控制的含有GFP-gpt基因表達(dá)盒克隆入DEV UL2基因中,構(gòu)建含GFP基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pT-UL2-GFP-gpt;用脂質(zhì)體將其與DEV細(xì)胞適應(yīng)株共轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞,待80%細(xì)胞出現(xiàn)病變后,凍融3次,接種到新鮮CEF細(xì)胞單層的6孔培養(yǎng)板中,用含5%血清、1%雙抗、1%瓊脂的M199培養(yǎng)液覆蓋,在熒光顯微鏡下挑取單個(gè)有綠色熒光的蝕斑,再接到新的細(xì)胞上,重復(fù)蝕斑篩選、純化表達(dá)綠色熒光蛋白的重組病毒;利用PCR、基因測(cè)序技術(shù)鑒定重組病毒;重組病毒接種CEF(moi=0.01),每12h取出1瓶接毒細(xì)胞,分別收集上清和細(xì)胞,測(cè)量其病毒含量,繪制一步生長(zhǎng)曲線;重組病毒在CEF中連續(xù)傳代20次,在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況,并用PCR檢測(cè)GFP的傳代穩(wěn)定性;重組病毒免疫4周齡SPF鴨后14d,肌肉注射接種DEV強(qiáng)毒(CVCC AV1221),觀察免疫保護(hù)情況�！窘Y(jié)果】經(jīng)雙酶切鑒定,成功構(gòu)建了含綠色熒光蛋白報(bào)告基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體p T-UL2-GFP-gpt,將其與DEV共轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞后8h,即可見轉(zhuǎn)染細(xì)胞中有帶有綠色熒光的梭形細(xì)胞,經(jīng)過8輪蝕斑篩選,獲得純化的重組病毒rDEV-△UL2-GFP-gpt;PCR鑒定及基因測(cè)序結(jié)果顯示,GFP標(biāo)記基因成功地插入到DEV基因組中,替換了DEV UL2基因的196—723位核苷酸;一步生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示,重組病毒在細(xì)胞和上清中的病毒含量分別在36h和72h達(dá)到峰值,為10~(6.2)TCID_(50)/0.1m L、10~(5.5)TCID_(50)/0.1m L,與親本毒無明顯差異;重組病毒在CEF中連續(xù)傳代,1—5代可以穩(wěn)定表達(dá)GFP基因,第6代起,開始出現(xiàn)少量沒有熒光的細(xì)胞病變,15—20代中絕大部分細(xì)胞病變無綠色熒光,GFP在細(xì)胞連續(xù)傳代過程中容易出現(xiàn)突變;重組病毒以10~(3.0)TCID_(50)/只免疫麻鴨,免疫后14d能完全抵抗DEV強(qiáng)毒株的攻擊,與親本毒免疫原性一致�！窘Y(jié)論】成功構(gòu)建了表達(dá)綠色熒光蛋白的DEV,首次證實(shí)UL2基因缺失不影響其在細(xì)胞中的復(fù)制,也不影響其免疫原性。熒光重組病毒的構(gòu)建為DEV UL2基因功能、活載體疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:[objective] there were significant differences among different strains of duck enteritis virus (DEAV). The UL2 gene of DEV vaccine strain was deleted 528 BP after 195bp, which led to the deletion of 176aaAU after 65th amino acid.The green fluorescent protein (GFP) gene was inserted into the DEV UL2 gene to obtain the recombinant virus expressing green fluorescent protein.In order to study the effect of UL2 gene on the biological characteristics of DEV and explore the feasibility of expressing exogenous gene with DEV as a vector, [methods] DNA, an adaptive cell line of DEV cells, was used as a template.The upstream and downstream sequences of the virus UL2 gene were amplified by PCR and cloned into the pMD-18T vector. The CMV promoter controlled GFP-gpt gene expression box was inserted into the DEV UL2 gene with UL2 gene as the target and homologous recombination arm.A single green fluorescent plaque was selected under a fluorescence microscope and then was inserted into a new cell. The recombinant virus expressing green fluorescent protein was purified by repeated plaque screening.The results of PCR identification and gene sequencing of purified recombinant virus rDEVUL2-GFP-gptHN showed that the GFP-labeled gene was successfully inserted into the DEV genome and replaced the 196-723 nucleotides of the DEV UL2 gene, and the results of one-step growth curve showed that the GFP-labeled gene was successfully inserted into the DEV genome and replaced the 196-723 nucleotides of the DEV UL2 gene.The virus content of recombinant virus in cell and supernatant reached its peak at 36h and 72h, respectively, which was 10~(6.2)TCID_(50)/0.1m L10, 5.5TCIDD / 0.1 L, which had no significant difference with parental virus, and the recombinant virus could express GFP gene stably in 1-5 passages of CEF, and the sixth generation.In the 15-20 passage, most of the cytopathic diseases were easy to mutate in the continuous passage of cells, and the recombinant virus was only immunized with 10~(3.0)TCID_(50)/.On the 14th day after immunization, DEV could completely resist the attack of DEV virulent strain, which was consistent with the immunogenicity of parent virus. [conclusion] the expression of green fluorescent protein was successfully constructed. It was proved for the first time that the deletion of UL2 gene did not affect its replication in cells.Nor does it affect its immunogenicity.The construction of fluorescent recombinant virus lays a foundation for the study of DEV UL2 gene function and live vector vaccine.
【作者單位】： 中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;
【基金】：北京市自然科學(xué)基金(6162025)
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：1701015