本文選題：奶牛乳腺上皮細胞　切入點：亮氨酸　出處：《吉林大學》2015年碩士論文

【摘要】：本試驗主要以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞為模型，研究亮氨酸濃度對乳腺上皮細胞中酪蛋白合成的影響和機理研究，旨在揭示不同濃度的亮氨酸在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)控酪蛋白合成的分子機理，以提高乳蛋白的含量，從而為改善乳品質(zhì)提供一定的理論依據(jù)；此外該研究還以永生化的奶牛乳腺上皮細胞為模型，建立了酪蛋白合成的非細胞體系（cell-free model），以模擬亮氨酸調(diào)控乳蛋白合成的信號通路，從而為體外氨基酸對乳蛋白合成的研究提供一種新的研究方法。本試驗包括以下三部分： 1.以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞為模型，采用噻唑藍（MTT）法研究不同濃度的亮氨酸添加水平和培養(yǎng)時間對乳腺上皮細胞增殖的影響，得出亮氨酸作用的最佳條件（包括作用濃度和作用時間），為后續(xù)試驗提供參考，同時也為闡明亮氨酸能促進乳腺上皮細胞增殖的機制提供一些依據(jù)。試驗采用完全隨機設計，以0.00mM/L亮氨酸處理為對照組（0組），試驗組培養(yǎng)基分別添加0.1125mM/L（0.25組），，0.225mM/L（0.5組），0.45mM/L（1組），0.9mM/L（2組），1.8mM/L（4組），3.6mM/L（8組），7.2mM/L（16組），14.4mM/L（32組）的亮氨酸；培養(yǎng)時間分別為24h、48h和72h。試驗重復3次。結果表明：亮氨酸在0.45~3.6mM/L（1組~8組）時對奶牛乳腺上皮細胞的增殖作用明顯，且在48h培養(yǎng)時間時其促增殖作用最強（P0.01）。 2.以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞為模型，研究不同濃度的亮氨酸對乳腺上皮細胞中酪蛋白合成相關基因的影響。試驗以0.00mM/L亮氨酸處理為對照組（0組），試驗組培養(yǎng)基分別添加0.1125mM/L（0.25組），0.225mM/L（0.5組），0.45mM/L（1組），0.9mM/L（2組），1.8mM/L（4組），3.6mM/L（8組），7.2mM/L（16組），14.4mM/L（32組）的亮氨酸。先對細胞進行4h的饑餓處理，然后添加不同水平的亮氨酸處理48h，每個處理3個重復，試驗也重復3次。采用熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術檢測不同濃度亮氨酸處理條件下酪蛋白及其合成相關基因的表達量，找出最佳的亮氨酸作用濃度。結果表明：1）亮氨酸促進酪蛋白基因表達的最佳濃度為0.9mM/L。此水平下，αs1-酪蛋白(αs1-casein，CSN1S1)、αs2-酪蛋白(αs2-casein，CSN1S2)、β-酪蛋白（β-casein，CSN2）和κ-酪蛋白（κ-casein, CSN3）的基因表達量均顯著上調(diào)，且與對照組相比差異顯著（P0.05）。2）亮氨酸促進酪蛋白合成轉(zhuǎn)錄和翻譯基因表達的最佳濃度也為0.9mM/L。此水平下，與酪蛋白轉(zhuǎn)錄相關JAK2-STAT5信號通路的基因，信號轉(zhuǎn)換和轉(zhuǎn)錄激活因子5（Signal transducers and activators of transcription5，STAT5）和酪氨酸激酶2（Janus Kinases2，JAK2）的表達均上調(diào)，與對照組相比差異均顯著（P0.05）。與酪蛋白翻譯相關的mTOR信號通路中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白基因（mammalian target of rapamycin， mTOR）和p70核糖體蛋白S6激酶1（ribosomal protein S6kinase-1，S6K1）基因的表達均上調(diào)，而且與對照組相比，二者的基因表達量差異均顯著（P0.05），但真核翻譯起始因子4E結合蛋白1（Eukaryotic translation initiation factor4E binding protein1，4E-BP1）表達下調(diào)，與對照組相比差異也顯著（P0.05）。 3.以永生化的奶牛乳腺上皮細胞（CMEC-H）為基礎，構建了體外模擬氨基酸調(diào)控乳蛋白合成的非細胞體系（cell-free model）。此非細胞體系構建之前，探究了穿針法（Gauge26，G26）溫和裂解CMEC-H的方法。該非細胞體系主要由粗提溶酶體組分（Crude lysosomes，CLF）和胞漿蛋白（Supernant-100，S100）組成。結果表明：所構建的非細胞體系能有效模擬氨基酸感應哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路中的兩項典型特征：必需氨基酸和亮氨酸都能夠激活蛋白mTOR，使mTOR在Ser2448位點發(fā)生磷酸化；激活之后的mTOR能從胞漿蛋白組分中移至粗提溶酶體組分。另外研究還發(fā)現(xiàn)了一種較好地溫和裂解CMEC-H的方法，即穿G26針孔25次。 結論：綜合本研究結果，當亮氨酸濃度為0.9mM/L時，奶牛乳腺上皮細胞的促增殖作用最大，并顯著促進了4種酪蛋白編碼基因的表達量和酪蛋白合成相關轉(zhuǎn)錄和翻譯基因的表達。而且以永生化的奶牛乳腺上皮細胞為基礎，所構建的非細胞體系能有效模擬氨基酸感應乳蛋白合成信號通路的主要特征。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S823

【參考文獻】

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本文編號：1685371