發(fā)布時(shí)間：2018-03-30 09:41

  本文選題：奶牛乳腺上皮細(xì)胞　切入點(diǎn)：亮氨酸　出處：《吉林大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：本試驗(yàn)主要以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型，研究亮氨酸濃度對(duì)乳腺上皮細(xì)胞中酪蛋白合成的影響和機(jī)理研究，旨在揭示不同濃度的亮氨酸在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)控酪蛋白合成的分子機(jī)理，以提高乳蛋白的含量，從而為改善乳品質(zhì)提供一定的理論依據(jù)；此外該研究還以永生化的奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型，建立了酪蛋白合成的非細(xì)胞體系（cell-free model），以模擬亮氨酸調(diào)控乳蛋白合成的信號(hào)通路，從而為體外氨基酸對(duì)乳蛋白合成的研究提供一種新的研究方法。本試驗(yàn)包括以下三部分： 1.以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型，采用噻唑藍(lán)（MTT）法研究不同濃度的亮氨酸添加水平和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響，得出亮氨酸作用的最佳條件（包括作用濃度和作用時(shí)間），為后續(xù)試驗(yàn)提供參考，同時(shí)也為闡明亮氨酸能促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖的機(jī)制提供一些依據(jù)。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，以0.00mM/L亮氨酸處理為對(duì)照組（0組），試驗(yàn)組培養(yǎng)基分別添加0.1125mM/L（0.25組），，0.225mM/L（0.5組），0.45mM/L（1組），0.9mM/L（2組），1.8mM/L（4組），3.6mM/L（8組），7.2mM/L（16組），14.4mM/L（32組）的亮氨酸；培養(yǎng)時(shí)間分別為24h、48h和72h。試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果表明：亮氨酸在0.45~3.6mM/L（1組~8組）時(shí)對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖作用明顯，且在48h培養(yǎng)時(shí)間時(shí)其促增殖作用最強(qiáng)（P0.01）。 2.以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型，研究不同濃度的亮氨酸對(duì)乳腺上皮細(xì)胞中酪蛋白合成相關(guān)基因的影響。試驗(yàn)以0.00mM/L亮氨酸處理為對(duì)照組（0組），試驗(yàn)組培養(yǎng)基分別添加0.1125mM/L（0.25組），0.225mM/L（0.5組），0.45mM/L（1組），0.9mM/L（2組），1.8mM/L（4組），3.6mM/L（8組），7.2mM/L（16組），14.4mM/L（32組）的亮氨酸。先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行4h的饑餓處理，然后添加不同水平的亮氨酸處理48h，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)也重復(fù)3次。采用熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)不同濃度亮氨酸處理?xiàng)l件下酪蛋白及其合成相關(guān)基因的表達(dá)量，找出最佳的亮氨酸作用濃度。結(jié)果表明：1）亮氨酸促進(jìn)酪蛋白基因表達(dá)的最佳濃度為0.9mM/L。此水平下，αs1-酪蛋白(αs1-casein，CSN1S1)、αs2-酪蛋白(αs2-casein，CSN1S2)、β-酪蛋白（β-casein，CSN2）和κ-酪蛋白（κ-casein, CSN3）的基因表達(dá)量均顯著上調(diào)，且與對(duì)照組相比差異顯著（P0.05）。2）亮氨酸促進(jìn)酪蛋白合成轉(zhuǎn)錄和翻譯基因表達(dá)的最佳濃度也為0.9mM/L。此水平下，與酪蛋白轉(zhuǎn)錄相關(guān)JAK2-STAT5信號(hào)通路的基因，信號(hào)轉(zhuǎn)換和轉(zhuǎn)錄激活因子5（Signal transducers and activators of transcription5，STAT5）和酪氨酸激酶2（Janus Kinases2，JAK2）的表達(dá)均上調(diào)，與對(duì)照組相比差異均顯著（P0.05）。與酪蛋白翻譯相關(guān)的mTOR信號(hào)通路中哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白基因（mammalian target of rapamycin， mTOR）和p70核糖體蛋白S6激酶1（ribosomal protein S6kinase-1，S6K1）基因的表達(dá)均上調(diào)，而且與對(duì)照組相比，二者的基因表達(dá)量差異均顯著（P0.05），但真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1（Eukaryotic translation initiation factor4E binding protein1，4E-BP1）表達(dá)下調(diào)，與對(duì)照組相比差異也顯著（P0.05）。 3.以永生化的奶牛乳腺上皮細(xì)胞（CMEC-H）為基礎(chǔ)，構(gòu)建了體外模擬氨基酸調(diào)控乳蛋白合成的非細(xì)胞體系（cell-free model）。此非細(xì)胞體系構(gòu)建之前，探究了穿針?lè)ǎ℅auge26，G26）溫和裂解CMEC-H的方法。該非細(xì)胞體系主要由粗提溶酶體組分（Crude lysosomes，CLF）和胞漿蛋白（Supernant-100，S100）組成。結(jié)果表明：所構(gòu)建的非細(xì)胞體系能有效模擬氨基酸感應(yīng)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路中的兩項(xiàng)典型特征：必需氨基酸和亮氨酸都能夠激活蛋白mTOR，使mTOR在Ser2448位點(diǎn)發(fā)生磷酸化；激活之后的mTOR能從胞漿蛋白組分中移至粗提溶酶體組分。另外研究還發(fā)現(xiàn)了一種較好地溫和裂解CMEC-H的方法，即穿G26針孔25次。 結(jié)論：綜合本研究結(jié)果，當(dāng)亮氨酸濃度為0.9mM/L時(shí)，奶牛乳腺上皮細(xì)胞的促增殖作用最大，并顯著促進(jìn)了4種酪蛋白編碼基因的表達(dá)量和酪蛋白合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄和翻譯基因的表達(dá)。而且以永生化的奶牛乳腺上皮細(xì)胞為基礎(chǔ)，所構(gòu)建的非細(xì)胞體系能有效模擬氨基酸感應(yīng)乳蛋白合成信號(hào)通路的主要特征。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S823

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1685371